馬有剛，康峰光，徐如林，徐 蘭，蔡安平，曾繁芳，黎勵(lì)文，麥煒頤

（1.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科//國家衛(wèi)生健康委員會(huì)輔助循環(huán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（中山大學(xué)），廣東廣州 510080；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)順德醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東佛山 528300；3.廣東省人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東廣州 510080；4.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院深圳醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東深圳 518057）

冠狀動(dòng)脈阻塞引起的持續(xù)性缺血可引起心肌梗死（myocardial infarction，MI），進(jìn)而導(dǎo)致心肌纖維化（cardiac fibrosis，CF）并最終進(jìn)展為心力衰竭（heart failure，HF）。盡管通過溶栓治療或直接經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（primary percutaneous coronary intervention，PPCI）及時(shí)進(jìn)行再灌注，但仍有相當(dāng)多的患者進(jìn)展為HF 甚至死亡［1］。因此，涉及再灌注預(yù)后相關(guān)的研究可以進(jìn)一步使這些人群受益。先前的研究表明心肌組織內(nèi)血管的內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（endothelial-mesenchymal transition，EndMT）可能參與MI及CF的發(fā)生、發(fā)展［2-4］。當(dāng)缺血性微環(huán)境改變后，心組織內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞可能會(huì)經(jīng)歷EndMT并離開微血管床進(jìn)入間質(zhì)，在那里它們分化為成纖維細(xì)胞，從而在血管周圍區(qū)域產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致心臟微血管功能障礙，進(jìn)而減少其血液供應(yīng)。盡管適度的EndMT有助于MI后肉芽組織的形成參與心臟修復(fù)，但過量的纖維疤痕也會(huì)導(dǎo)致心室重構(gòu)和HF。在EndMT 期間，血管內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)失去其特定的內(nèi)皮標(biāo)記物，如血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule，PECAM/CD31），獲得包括平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）在內(nèi)的間質(zhì)標(biāo)記物［5-6］。中醫(yī)藥在心血管疾病防治中具有一定作用，其中復(fù)方丹參滴丸（compound Danshen dripping pills，CDDP）于1994 年獲得中國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于治療缺血性心絞痛。研究表明，CDDP 可以通過改善心功能、預(yù)防心肌缺血和凋亡、減少心肌損傷和纖維化從而產(chǎn)生心血管保護(hù)作用［7］。在體內(nèi)心肌缺血-再灌注（myocardial ischemia reperfusion，MIR）模型中，CDDP 可以減輕心的微循環(huán)障礙和心肌損傷、減少M(fèi)IR 損傷并改善心肌纖維化［8-10］。早期的研究發(fā)現(xiàn)CDDP可以保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞［11-12］。由于EndMT 參與MI 及CF 的發(fā)生發(fā)展過程，因此，我們推測在冠狀動(dòng)脈阻塞導(dǎo)致的MIR 中，CDDP 可能通過保護(hù)心組織內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)而抑制過度EndMT的發(fā)生而發(fā)揮上述心血管保護(hù)作用。因此，在這項(xiàng)研究中，我們探討了MIR 后不同劑量CDDP對(duì)心功能的影響，進(jìn)而研究其對(duì)CF的作用，及在心肌微血管EndMT這一病理過程的作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、試劑及材料

小動(dòng)物呼吸機(jī)（上海繼德器械），生理信號(hào)采集和處理系統(tǒng)（四川成都儀器），體溫維持儀（上海玉研儀器），動(dòng)物手術(shù)器械包（深圳瑞沃德生命科技），小動(dòng)物氣體麻醉機(jī)（深圳瑞沃德生命科技），小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)（加拿大FUJIFILM VisualSonics），組織處理系統(tǒng)（美國Thermo Scientific），石蠟包埋系統(tǒng)及切片系統(tǒng)（德國Leica Biosystems），熒光及明場掃描系統(tǒng)（奧地利Taborstrasse），化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國ProteinSimple），復(fù)方丹參滴丸（天津天士力醫(yī)藥集團(tuán)有限公司提供），戊巴比妥鈉（山東西亞試劑），Western 細(xì)胞裂解液及PMSF、SDS-PAGE 試劑盒（上海碧云天生物），ECL 底物（美國Thermo Scientific），HE 染色及Masson 三色染色試劑盒（武漢賽維爾生物），PVDF 膜（德國Merck KGaA），兔抗大鼠α-SMA（英國Abcam），兔抗大鼠CD31（英國Abcam），兔抗大鼠GAPDH（杭州華安生物），山羊抗兔二抗（美國Jackson ImmunoResearch），山羊抗小鼠二抗（美國Thermofisher），免疫熒光抗體α-SMA（美國Affinity），免疫熒光抗體CD31（英國Abcam），Alexa Fluor 488偶聯(lián)二抗（美國Life Technologies）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

該研究已獲得廣州永諾生物動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，倫理編號(hào)為IACUCG16033。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均按照National Research Council 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)護(hù)和使用指南（2011 版）進(jìn)行相應(yīng)處置。40 只8 周齡雄性SD 大鼠，體質(zhì)量（250±20）g，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物育種有限公司。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在溫度為（25±2）°C、晝夜周期為12 h、相對(duì)濕度為（50±10）%的SPF 動(dòng)物房飼養(yǎng)。將CDDPs 藥丸溶于生理鹽水中配制成不同劑量溶液，使用前充分混勻。大鼠在手術(shù)前被隨機(jī)分為以下5 組：假手術(shù)組（等量生理鹽水灌胃），心肌缺血-再灌注模型組分為對(duì)照組（等量生理鹽水灌胃）及CDDP 低、中、高劑量組（分別給予40、80、120 mg·kg-1·d-1CDDP灌胃）。所有動(dòng)物從術(shù)后第2天灌胃給藥，持續(xù)4周。

1.3 心肌缺血-再灌注模型

按照我們既往的方法建立MIR 模型［13］。大鼠在7 d 的適應(yīng)性飼養(yǎng)和檢疫后，腹腔注射戊巴比妥鈉（40～50 mg/kg）進(jìn)行麻醉。夾趾反應(yīng)確保麻醉后進(jìn)行氣管插管，設(shè)置呼吸機(jī)參數(shù)使其與麻醉大鼠的呼吸頻率同步，然后將氣管插管連接至呼吸機(jī)。手術(shù)前，使用生理信號(hào)收集和處理系統(tǒng)記錄大鼠心電圖。經(jīng)胸骨左緣第3 肋間隙開胸，7-0 絲線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支（LAD）。45 min 后，松開結(jié)扎線進(jìn)行再灌注。假手術(shù)組僅開胸，并在相應(yīng)部位穿線但不結(jié)扎LAD。手術(shù)后，繼續(xù)對(duì)大鼠進(jìn)行15 min的心電監(jiān)測，并將其置于30℃的加熱墊上直至蘇醒。

1.4 超聲心動(dòng)圖

5%異氟烷吸入預(yù)麻醉大鼠，待動(dòng)物麻醉后迅速轉(zhuǎn)移到Vevo?3100 小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)的加熱墊，并以1-2%的異氟烷維持麻醉。剃除左前胸的皮毛，涂抹少量超聲耦合劑，然后使用MX250 超聲探頭（頻率18～25 MHz）測量胸骨旁左心室短軸切面（乳頭肌水平）和心室長軸切面的M 模式圖像。通過多普勒超聲測量二尖瓣E 波及A 波的峰流速（單位cm/s）和其比值（E/A ratio）評(píng)估心臟舒張功能。所有圖像均以原始格式（DICOM）進(jìn)行保存，并使用FUJIFILM VisualSonics 的配套軟件包VevoLAB 3.0獲取超聲數(shù)據(jù)。

1.5 樣本采集與制備

10%水合氯醛麻醉大鼠，固定四肢后開胸，獲取鼠心，去除心耳及血管組織，并將其橫切為兩部分。心底1/2 組織使用液氮速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。心尖1/2組織固定于40 g/L多聚甲醛，第2天轉(zhuǎn)移至70%乙醇溶液中，然后使用組織處理系統(tǒng)Excelsior?AS 進(jìn)行梯度乙醇脫水、二甲苯透明及液體石蠟浸蠟，隨后通過石蠟包埋系統(tǒng)HistoCore Arcadia 進(jìn)行包埋留待后續(xù)形態(tài)學(xué)及病理學(xué)實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物尸體按照中山大學(xué)動(dòng)物倫理及福利規(guī)定統(tǒng)一進(jìn)行無害化處理。

1.6 組織學(xué)及形態(tài)學(xué)分析

將包埋的鼠心組織在石蠟切片系統(tǒng)以5 μm 連續(xù)切片，然后按照試劑盒說明進(jìn)行HE 染色及Masson三色染色。石蠟切片脫蠟至水，HE 染色依次進(jìn)行蘇木素染色3～5 min，自來水沖洗，分化液分化3 s，自來水沖洗，返藍(lán)液返藍(lán)約3 s，自來水沖洗，85%和95%乙醇依次脫水各4 min，伊紅染液4～5 min，無水乙醇脫水3次每次4～5 min，正丁醇透明4～5 min，二甲苯透明兩次每次2～4 min，中性樹膠封片。Masson 染色依次進(jìn)行Masson A 液15 h，65℃烤箱加熱30 min，自來水沖洗，Masson B 液及C 液混合染色1 min，自來水沖洗，1%鹽酸酒精分化1 min，自來水沖洗，Masson D 液浸染6 min，快速水洗，Masson E 液浸染約1 min，Masson F 液浸染8 s～15 s，1%冰醋酸漂洗分化3 次每次8 s，無水乙醇脫水3次每次4～5 min，二甲苯透明兩次每次2～4 min，中性樹膠封片。所有玻片均通過熒光及明場掃描系統(tǒng)TissueFAXS PLUS 以200×進(jìn)行掃描。Masson三色染色的膠原容積分?jǐn)?shù)（collagen volume fraction，CVF）通過ImageJ（版本1.8.0）插件進(jìn)行計(jì)算［14］。

1.7 免疫熒光檢測

石蠟切片脫蠟至水，二甲苯透明3 次，每次5 min，梯度酒精（無水、95%、75%）分別脫水5 min，TBS 沖洗3 次每次3 min。pH9.0 EDTA 高壓鍋抗原修復(fù)2 min，蒸餾水浸洗3 min。3% H2O2阻斷30 min，蒸餾水浸洗3 min，組畫筆畫圈后置于TBST，10%山羊血清室溫封閉30 min。棄去血清，每張玻片滴加CD31（1：800）約50 μL，4 ℃孵育過夜。次日，TBST 沖洗3 次玻片，每張玻片滴加50 μL HRP偶聯(lián)的山羊抗兔二抗（1：4 000），37 ℃孵育45 min，TBST 沖洗3 次每次5min。滴加50 μL CY3 工作液（1：200），室溫孵育10 min，TBST 浸洗3 次，每次5 min。pH6.0 檸檬酸抗原修復(fù)5 min，蒸餾水浸洗3 min。組畫筆畫圈后置于TBST，10%山羊血清室溫封閉30 min。棄去血清，每張玻片滴加α-SMA（1：200）約50 μL，4 ℃孵育過夜。第3 天，TBST 沖洗3 次玻片，每張玻片滴加50 μL Alexa Fluor488 偶聯(lián)的驢抗兔二抗（1：400），37 ℃孵育45 min，TBST浸洗3 次每次5 min。每張玻片滴加50 μL DAPI 工作液（1：500），避光染核5 min，TBST 沖洗。熒光封片劑封片，避光保存。所有玻片均通過熒光和明場掃描系統(tǒng)TissueFAXS PLUS 進(jìn)行掃描，隨機(jī)采集CD31/α-SMA 陽性染色鼠心組織微血管的400×放大照片。使用ImageJ（版本1.8.0）測量α-SMA 的平均灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.8 蛋白質(zhì)印跡分析

按照試劑說明書，使用細(xì)胞裂解液從約150 mg的梗死周邊心室組織中提取組織總蛋白。14 000×g離心取上清，混合加樣緩沖液，100 ℃煮沸10 min變性蛋白質(zhì)。將約50 μg 蛋白質(zhì)在5%～15%的SDS-PAGE中進(jìn)行電泳，然后轉(zhuǎn)移到0.22 μm PVDF膜上，并在4℃下與CD31（1：1 000）、α-SMA（1：1 000）及GAPDH（1：5 000）孵育過夜。次日，使用TBST 清洗膜并與HRP 偶聯(lián)二抗（1：10 000）室溫孵育1 h，然后在膜上滴加ECL 底物并在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)FluorChem?E中進(jìn)行曝光。蛋白質(zhì)條帶的積分光密度（Integrated Density，IntDen）使用ImageJ 軟件（版本1.8.0）進(jìn)行測量，計(jì)算靶蛋白/內(nèi)參蛋白的IntDen 比值，然后將其余4 組比值/NS 組比值獲得IntDen 比值的倍數(shù)。每個(gè)靶蛋白均進(jìn)行3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均以Mean±SEM 或Mean±SD 表示（在圖注中有詳細(xì)說明）。數(shù)據(jù)在Shapiro-Wilk 正態(tài)性檢驗(yàn)后，各組定量資料都呈正態(tài)分布并且作方差齊性檢驗(yàn)。方差齊資料用單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行分析；反之用多組獨(dú)立樣本Kruskal-WallisH非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)使用Bonferroni法進(jìn)行多重比較。P＜0.05的被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS 26.0進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)中心電圖監(jiān)測結(jié)果

為了確保缺血-再灌注模型的穩(wěn)定性，所有動(dòng)物均在術(shù)中進(jìn)行心電監(jiān)測。如圖1 所示，心電監(jiān)測顯示結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支后出現(xiàn)超急性期心肌缺血心電圖表現(xiàn)，即T 波逐漸升高；數(shù)分鐘后出現(xiàn)急性期心肌缺血心電圖表現(xiàn)，即ST 段抬高直至弓背向上；結(jié)扎30 min 時(shí)，心電圖出現(xiàn)寬而大的Q 波（即病理性Q 波）。45 min 后，松開結(jié)扎線進(jìn)行再灌注，抬高的ST段逐漸恢復(fù)正常。

圖1 流程圖及代表性術(shù)中心電圖Fig.1 Flow diagram and representative electrocardiograms

2.2 復(fù)方丹參滴丸對(duì)缺血-再灌注大鼠心功能的作用

為了研究CDDP 對(duì)缺血-再灌注大鼠心功能的作用，在干預(yù)終點(diǎn)進(jìn)行了超聲心動(dòng)圖。如圖2B 所示，超聲結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，NS 組左室射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）和短軸縮短率（fractional shortening，F(xiàn)S）顯著降低（分別為F=13.467、P=0.000；F=13.587、P=0.000），而左室舒張末期容積（left ventricular end-diastolic volume，LVEDV）及E/A 比率顯著升高（分別為F=11.333、P=0.001；F=17.590、P=0.000），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別為PEF=0.000、PFS=0.000、PLVEDV=0.001 及PE/A=0.000）。而與NS 組相比，低、中、高劑量CDDP 可改善EF（分別為PL=0.015、PM=0.016、PH=0.008）及FS（分別為PL=0.022、PM=0.022、PH=0.012），減少了LVEDV（分別為PL=0.002、PM=0.011、PH=0.003）并降低了E/A 比率（分別為PL=0.154、PM=0.008、PH=0.005），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，不同劑量CDDP 組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 不同劑量復(fù)方丹參滴丸對(duì)缺血再灌注大鼠心功能的作用Fig.2 Effect of different doses of compound Danshen dripping pills on cardiac function in rats with ischemia-reperfusion

2.3 復(fù)方丹參滴丸對(duì)缺血-再灌注鼠心微環(huán)境及纖維化的作用

為了評(píng)估CDDP 對(duì)缺血-再灌注鼠心組織形態(tài)的作用，在干預(yù)終點(diǎn)進(jìn)行了鼠心組織的HE 及Masson染色。HE 染色結(jié)果表明，假手術(shù)組心肌纖維規(guī)律排列，無斷裂及壞死性間隙，細(xì)胞核梭形或橢圓形。各模型組可見心肌壞死，肌纖維斷裂、溶解，肌間隙增大。如圖3C所示，Masson 染色結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，各試驗(yàn)組均出現(xiàn)不同程度纖維化（F=22.753，P=0.000），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（NS 組P=0.000，低、中、高劑量組分別P=0.003、0.002、0.001）。且不同劑量CDDP 組纖維化程度均較NS組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（低、中、高劑量組分別P=0.014、0.022、0.036）。然而，不同劑量CDDP 組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 復(fù)方丹參滴丸對(duì)缺血-再灌注鼠心微血管內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用

為了評(píng)估CDDP 對(duì)缺血-再灌注鼠心微血管內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用，在干預(yù)終點(diǎn)進(jìn)行了鼠心微血管的CD31/α-SMA 免疫熒光染色。如圖4A 所示，CY3 標(biāo)記的CD31（紅色熒光）作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記物，而Alexa Fluor488 標(biāo)記的α-SMA（綠色熒光）作為血管平滑肌細(xì)胞的標(biāo)記物。圖4B 的α-SMA 免疫熒光半定量結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，各實(shí)驗(yàn)組間質(zhì)標(biāo)記物α-SMA 的平均熒光強(qiáng)度（mean gray value，MGV）均顯著增強(qiáng)（F=88.232，P=0.000），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（NS 組、中和高劑量組調(diào)整的顯著性分別PN=0.000、PM=0.000、PH=0.000）。而3 個(gè)CDDP 組MGV 均較NS 組顯著減弱（調(diào)整的顯著性分別PL=0.000、PM=0.001、PH=0.041），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間比較結(jié)果顯示，高劑量組MGV 較低劑量組略增強(qiáng)（P=0.009），而另兩個(gè)CDDP 組間MGV 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 復(fù)方丹參滴丸對(duì)缺血-再灌注大鼠心室組織內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用

為了評(píng)估CDDP 對(duì)缺血-再灌注大鼠心室組織內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用，進(jìn)行了梗死周邊心室組織總蛋白的Western Blot。如圖5所示，數(shù)據(jù)以倍數(shù)表示，與假手術(shù)組比較，NS 組的CD31 表達(dá)顯著降低（0.76±0.02），而不同劑量CDDP 較NS 組顯著增加了CD31 的表達(dá)（低劑量組：1.06±0.03、中劑量組：1.26±0.04、高劑量組：1.26±0.03）。NS 組的α-SMA表達(dá)比假手術(shù)組顯著升高（1.25±0.01），而不同劑量CDDP 較NS 組顯著降低了α-SMA 的表達(dá)（低劑量組：0.91±0.01、中劑量組：0.79±0.01、高劑量組：0.83±0.01）。

3 討論

本研究通過45min 的LAD 結(jié)扎隨后開放建立MIR 大鼠模型，然后給予不同劑量CDDP 灌胃治療4 周。結(jié)果表明，CDDP 可以改善大鼠再灌注后的心功能，改善再灌注后的鼠心微環(huán)境，減少心肌纖維化。

解剖學(xué)上，心主要有兩種內(nèi)皮細(xì)胞：心內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞（endocardial endothelial cells，EECs）和心臟血管的內(nèi)皮細(xì)胞（vascular endothelial cells，VECs），心臟中的VECs 主要存在于心室肌的致密層［15］，構(gòu)成小、微血管的內(nèi)皮。在病理生理上，穩(wěn)定功能的血管對(duì)于維持和恢復(fù)缺血心肌的心功能是必不可少的［3］。當(dāng)冠狀動(dòng)脈阻塞導(dǎo)致心肌缺血后，VECs脫離血管內(nèi)皮層，然后經(jīng)EndMT 轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致在血管周圍區(qū)域的間質(zhì)中生成大量細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），從而產(chǎn)生內(nèi)皮功能顯著減弱的間質(zhì)細(xì)胞［16］。最后，微環(huán)境被破壞，這又進(jìn)一步減少了已經(jīng)缺血心肌的血液供應(yīng)。因此，保護(hù)VECs 并減輕EndMT 的程度可能對(duì)缺血再灌注的心臟有益。我們的研究結(jié)果表明，不同劑量的CDDP 均可以在一定程度上抑制鼠心微血管EndMT的發(fā)生，這表現(xiàn)為在鼠心微血管免疫熒光染色中間質(zhì)標(biāo)記物α-SMA 表達(dá)的降低，和Western blot 檢測到梗死周邊心室組織中α-SMA 表達(dá)降低以及內(nèi)皮標(biāo)記物CD31表達(dá)增加。EndMT本質(zhì)上參與了心肌纖維化的發(fā)展過程［17］，因此纖維化程度也可以反映EndMT 的狀態(tài)。我們的數(shù)據(jù)表明，不同劑量CDDP 均可減少M(fèi)IR 后的心肌纖維化，提示CDDP 可能通過減少心組織內(nèi)血管的EndMT 而減輕了MIR心臟的纖維化。

心肌發(fā)生梗死時(shí)，收縮性肌纖維丟失，導(dǎo)致收縮功能發(fā)生障礙。因心肌梗死引起的間質(zhì)水腫和心肌纖維化，使左室順應(yīng)性受損進(jìn)而影響其舒張功能。而過度的EndMT 導(dǎo)致大量ECM 在心肌細(xì)胞外沉積，破壞了正常的心組織結(jié)構(gòu)，這也加劇了心肌纖維化的程度。我們的研究中，對(duì)照組的左室收縮功能障礙表現(xiàn)為EF 及FS 的顯著降低和LVEDV 的顯著升高，而舒張功能受損表現(xiàn)為E/A 的顯著升高。E/A 是體現(xiàn)舒張功能的指標(biāo)，其在急性心肌缺血及心肌梗死模型中均升高［18］。CDDP 治療結(jié)果表明，其不同劑量在改善鼠心收縮功能的同時(shí)對(duì)舒張功能也具有一定的作用。因此，通過減少心組織內(nèi)血管的EndMT 及減輕由此導(dǎo)致的心肌纖維化，可在一定程度上改善缺血及梗死后心功能。

CDDP 是一種由丹參、三七和冰片組成的復(fù)方中成藥，它在中國已有20 多年的用藥歷史。2016年，Dantonic?（CDDP 的膠囊制劑）完成了美國食品藥品監(jiān)督管理局的Ⅲ期臨床試驗(yàn)（ID：NCT01659580），Top-Line 分析報(bào)告顯示，Dantonic?可以顯著增加慢性穩(wěn)定型心絞痛患者的總體運(yùn)動(dòng)持續(xù)時(shí)間，并呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。臨床上，CDDP的劑量為270mg 每日3 次。在本研究中，我們參考多項(xiàng)研究［9，19］，同時(shí)根據(jù)Dantonic?Ⅱ期臨床試驗(yàn)的每日劑量（低劑量組：250 mg/d，高劑量組：375 mg/d），然后計(jì)算人與大鼠之間的體表面積差異得出動(dòng)物的劑量40、80、120 mg·kg-1·d-13 種劑量。我們的數(shù)據(jù)表明，CDDP 產(chǎn)生保護(hù)作用不完全呈現(xiàn)劑量依賴性。可能原因之一是由于其復(fù)雜的成分以及其在體內(nèi)多功能多靶標(biāo)的特點(diǎn)。最近的一項(xiàng)研究對(duì)CDDP 組分丹參的主要成分丹酚酸A（salvianolic acid，SAA）進(jìn)行了研究，結(jié)果表明SAA具有保護(hù)作用并減弱了缺氧誘導(dǎo)的人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的EndMT［20］。這與我們研究的結(jié)果類似，提示CDDP 抑制心組織內(nèi)血管EndMT作用的主要成分可能是SAA。

當(dāng)前冠狀動(dòng)脈疾病是最常見的心血管疾病。對(duì)于急性MI 患者，至關(guān)重要的是盡快開通梗阻的罪犯血管。但是，在血運(yùn)重建后，MI 的一些并發(fā)癥（例如“無復(fù)流”現(xiàn)象）仍然存在［21］。2018 年ESC/EACTS 指南建議，在血運(yùn)重建后，應(yīng)采取藥物治療和其他二級(jí)預(yù)防措施以及心臟康復(fù)策略，以降低心力衰竭來的發(fā)病率、死亡率并進(jìn)一步改善癥狀。一項(xiàng)早期的中國臨床研究用心肌聲學(xué)造影檢查了120 例接受或不接受2 個(gè)月CDDP 的PCI 患者的心臟微循環(huán)，發(fā)現(xiàn)CDDP 可有效改善急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）患者PCI 后心臟的微循環(huán)［22］。結(jié)合我們的研究，在ACS患者進(jìn)行再灌注治療之后給予CDDP 可能進(jìn)一步減少HF 的發(fā)生并改善長期預(yù)后。未來仍需要進(jìn)行大規(guī)模的臨床研究和更多的體外研究，以探索再灌注后其對(duì)缺血心臟保護(hù)的最佳方案和可能機(jī)制。

綜上所述，復(fù)方丹參滴丸40、80、120 mg·kg-1·d-1治療可改善大鼠心肌缺血-再灌注后的心功能，機(jī)制之一可能是通過抑制心組織內(nèi)血管內(nèi)皮-間質(zhì)過度轉(zhuǎn)化，進(jìn)而減少缺血-再灌注后心肌纖維化。