李孔耀，施譯琳，馬熙麟，田澤眾，鄒進(jìn)超，王銳杰，毛鈺蘅，楊 燕

（1.中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院（深圳），廣東深圳 518106；2.廣東省營養(yǎng)膳食與健康重點實驗室，廣東廣州 510080；3.廣東省營養(yǎng)轉(zhuǎn)化工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510080；4.中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東廣州 510080）

血小板是巨核細(xì)胞來源的無核血細(xì)胞，具有止血、凝血的基本生理功能［1］。線粒體在血小板的代謝和活化中發(fā)揮主要作用，線粒體損傷是血小板損傷的重要標(biāo)志［2］。已有研究發(fā)現(xiàn)，部分心血管疾?。╟ardiovascular diseases，CVD）患者的機體氧化水平升高，血小板內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）增加，導(dǎo)致血小板線粒體氧化損傷［3］。因此推測，抑制血小板的氧化損傷可能是防治CVD 的有效手段之一。自噬是溶酶體降解雙膜泡中受損蛋白和細(xì)胞器的過程，可以通過細(xì)胞內(nèi)自噬體形成清除受損線粒體［4］，生理性自噬有助于細(xì)胞新陳代謝和某些細(xì)胞器更新［5］。此外，在過氧化條件下，自噬具有促進(jìn)細(xì)胞生存的作用［4，6］，例如，糖尿病患者的血小板在過氧化狀態(tài)下增強自噬，清除部分ROS 和受損線粒體，可保護(hù)血小板免受氧化損傷［7-8］。此外，LC3 I 與磷酸二乙醇胺結(jié)合產(chǎn)生LC3 Ⅱ的過程與自噬小體形成有關(guān)，因此LC3 Ⅱ/Ⅰ的比值大小可以用來評估自噬水平的高低［4］。膳食營養(yǎng)素干預(yù)對于早期防治CVD 發(fā)揮著重要作用［9］。流行病學(xué)研究表明，膳食攝入番茄可降低心血管疾病的發(fā)生率［10］。水溶性番茄濃縮物（Fruitflow）是使用物理方法除去番茄中的脂溶性成分，并將水溶性成分濃縮而得到的。人群及體外研究表明Fruitflow 對血小板具有降低聚集、活化的作用［11-12］。并且，F(xiàn)ruitflow 及其主要的成分具有抗氧化作用［13-14］，然而它對血小板氧化損傷的作用仍不清楚，對血小板自噬的影響也未見報道。因此，本研究擬采用體外實驗，探討Fruitflow 對H2O2導(dǎo)致的血小板氧化損傷的影響，及血小板自噬在其中可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象

招募符合條件的健康志愿者：年齡25～40 歲，兩周內(nèi)未曾服用會改變血小板、凝血系統(tǒng)功能的藥物或營養(yǎng)補充劑（輔酶Q10、魚油等）；志愿者出現(xiàn)以下任何一種情況將予以排除，包括近半年患有心血管疾病、腫瘤等病史；或者吸煙、酗酒半年以上。研究經(jīng)中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院倫理委員會審批，并依照赫爾辛基宣言進(jìn)行，參與者對試驗方案知情同意。

1.2 主要試劑

Fruitflow 粉末獲自湯臣倍健公司；過氧化氫（Hydrogen peroxide，H2O2）和2′，7′-二氯熒光素二乙酸酯（2′，7′-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate，DCFH-DA）購自美國Sigma 公司；四甲基羅丹明甲酯（Tetramethylrhodamine methyl ester，TMRM）、一抗LC3 B 和二抗goat anti-rabbit、goat antimouse 購自英國abcam 公司；一抗phospho-p53（serine 15）、p53、p62、β-actin 購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

多功能酶標(biāo)儀美國Bio Tek 公司；流式細(xì)胞儀CytoFlex S 美國Beckman Coulter 公司；Tanon 5200發(fā)光成像系統(tǒng)中國Tanon公司。

1.4 方 法

1.4.1 制備純化血小板 清晨，對空腹志愿者用一次性靜脈采血針（0.7 mm×25 mm）從肘靜脈抽取15 mL 的血液，注入含檸檬酸鈉（1：9）的真空抗凝管中，離心（300×g，10 min，22 ℃），取上清為富血小板血漿。用Sepharose 2B 柱在PIPES（1L 溶液含PIPES 粉末8.38 g、NaCl 8.01 g、KCl 0.298 g 和葡萄糖1 g，pH 7.0）緩沖液中制備純化血小板，詳見已發(fā)表文獻(xiàn)［15］。

1.4.2 測定血小板線粒體膜電位 用不同劑量（0、20、40、80 mg/L）的Fruitflow 或溶劑對照與純化血小板在體外共同孵育30 min 后，離心棄上清，并重懸，加入H2O2（1 mmol/L）或溶劑對照繼續(xù)孵育40 min，孵育完成后，加入終濃度為400 nmol/L 的TMRM，迅速混勻，避光孵育20 min，流式細(xì)胞儀測定血小板線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，ΔΨm）水平，CytExpert 2.3分析。

1.4.3 測定血小板ROS 生成水平 純化后的血小板（1×106個/mL）與10 μmol/L 的DCFH-DA 共避光孵育30 min，離心棄上清，并重懸。用80 mg/L 的Fruitflow 或溶劑對照與純化血小板共孵育30 min，然后加入H2O2或溶劑對照，和3-MA（2 mmol/L）或溶劑對照，避光孵育60 min。收集細(xì)胞，用熒光微孔板檢測，在488 nm 處激發(fā)樣品，在525 nm 處測定熒光強度。

1.4.4 Western blot 收集Fruitflow 與H2O2處理后的血小板，并離心（12 000×g，4 ℃，15 min），得到細(xì)胞沉淀，加入混有（100：1）蛋白酶抑制劑的裂解液，冰上裂解30 min，再次離心（12 000 ×g，4 ℃，15 min）取上清即為血小板蛋白。用BCA 試劑盒測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液，混勻，制樣后-20 ℃保存。將樣本進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，用對應(yīng)的一抗（Phospho-p53、p53、p62、LC3 B、β-actin）4 ℃過夜孵育，洗膜，二抗常溫孵育。ECL 化學(xué)發(fā)光后成像儀成像，用Quantity one 計算灰度值。實驗至少重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)資料用SPSS 20.0 和GraphPad Prism 5.0軟件分析和繪制統(tǒng)計圖。圖中的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（standard error of mean，SEM）表示；采用單因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA）進(jìn)行多組間比較，方差分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義時兩兩比較采用Bonferroni 法，雙側(cè)P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Fruitflow對H2O2誘導(dǎo)的血小板損傷的影響

與單純H2O2組相比，40、80 mg/L 的Fruitflow 能顯著升高TMRM 陽性血小板水平，這提示Fruitflow具有降低血小板線粒體膜電位去極化的作用，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01；圖1）。

圖1 不同濃度Fruitflow對H2O2誘導(dǎo)的血小板線粒體膜電位去極化的影響Fig.1 Effect of Fruitflow on ΔΨm depolarization in H2O2-treated platelets

2.2 Fruitflow 對H2O2誘導(dǎo)的血小板ROS 生成的影響

H2O2可顯著提升血小板內(nèi)ROS 的水平（P＜0.000 1，圖2），這與其他人的研究結(jié)果一致［8］。80 mg/L 的Fruitflow 可顯著減少H2O2誘導(dǎo)的血小板ROS 生成（P＜0.01；圖2）。并且，自噬抑制劑3-MA可以有效的抑制Fruitflow 的這一作用（P＜0.05；圖2）。這提示自噬可能在Fruitflow 減輕血小板氧化損傷中起重要作用。

圖2 Fruitflow對H2O2誘導(dǎo)的血小板ROS生成的影響Fig.2 Effect of Fruitflow on ROS generation in H2O2-treated platelets

2.3 Fruitflow 降低H2O2誘導(dǎo)的血小板p53 蛋白磷酸化

20、40、80 mg/L 的Fruitflow 對p53 蛋白的表達(dá)并沒有顯著的影響（P＞0.05；圖3B）。但是，F(xiàn)ruitflow 可有效抑制H2O2誘導(dǎo)的p53 蛋白磷酸化水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05；圖3C）。

圖3 Fruitflow 對H2O2導(dǎo)致的血小板p53蛋白磷酸化的影響Fig.3 Effect of Fruitflow on p53 phosphorylation in H2O2-treated platelets

2.4 Fruitflow促進(jìn)血小板自噬

Western blot 結(jié)果顯示，與對照組相比，20、40、80 mg/L 的Fruitflow 可以顯著促進(jìn)LC3 ⅠⅠ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化（P＜0.05；圖4A），并降低p62 的表達(dá)（P＜0.05；圖4 B）。

圖4 Fruitflow 對血小板自噬的影響Fig.4 Effect of Fruitflow on autophagy in resting platelets

2.5 Fruitflow對H2O2處理血小板自噬的影響

H2O2可以促進(jìn)LC3 Ⅰ向LC3 Ⅱ轉(zhuǎn)化，這與其他人的研究結(jié)果一致。與單純H2O2組相比，80 mg/L的Fruitflow 也能顯著的促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)的血小板LC3 Ⅰ向LC3 Ⅱ轉(zhuǎn)化（P＜0.05；圖5）。

圖5 不同濃度的Fruitflow對H2O2促進(jìn)血小板自噬的影響Fig.5 Effect of Fruitflow on autophagy in H2O2-treated platelets

2.6 Fruitflow 通過促進(jìn)自噬減輕H2O2導(dǎo)致的血小板損傷

3-MA 可以顯著逆轉(zhuǎn)80 mg/L Fruitflow 升高H2O2處理后的血小板線粒體膜電位的效應(yīng)（P＜0.01；圖6）。并且，與3-MA 組相比，加入Fruitflow和3-MA 組的線粒體膜電位差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05；圖6）。

圖6 Fruitflow，3-MA對H2O2誘導(dǎo)的血小板線粒體膜電位去極化的影響Fig.6 Effect of Fruitflow，3-MA on ΔΨm depolariza?tion in H2O2-treated platelets

3 討論

氧化應(yīng)激反應(yīng)是CVD 的一個重要病理機制。例如，在糖脂代謝紊亂、高血壓等疾病中，機體處于過氧化狀態(tài)，從而導(dǎo)致血小板過氧化損傷［16-17］；在這一過程中，血小板線粒體出現(xiàn)功能障礙、損傷［2］；最終引起血小板反應(yīng)性升高（輕度線粒體損害）和磷脂酰絲氨酸外翻增多（嚴(yán)重線粒體損害）而加速血栓形成［16，18］。并且，體外實驗顯示用H2O2孵育血小板會直接導(dǎo)致線粒體損傷。已有研究表明1 mmol/L 的H2O2體外誘導(dǎo)血小板ROS 的增加量與糖尿病病人的血小板內(nèi)ROS 增量相一致，此種H2O2的濃度與其他研究誘導(dǎo)血小板損傷的濃度相一致，因此，本實驗采用的H2O2劑量濃度為1 mmol/L［3，8］。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ruitflow 可以抑制H2O2導(dǎo)致的血小板線粒體損傷，這可能與Fruitflow 預(yù)防CVD 相關(guān)。另外，p53在絲氨酸15位點的磷酸化可直接導(dǎo)致線粒體功能障礙，ROS 是p53 誘導(dǎo)線粒體損傷的早期事件［3］。本研究首次發(fā)現(xiàn)Fruitflow 可以減少H2O2導(dǎo)致的ROS 生成和p53（serine 15）磷酸化，從而減輕血小板氧化損傷。有研究表明，膳食營養(yǎng)素在癌細(xì)胞中可以促進(jìn)p53 的表達(dá)及磷酸化，但是在正常細(xì)胞系中，研究表明綠原酸、蘆丁、多酚（白黎蘆醇、姜黃素）可以通過抑制氧化應(yīng)激和p53 磷酸化來發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。Fruitflow 的主要成分包括綠原酸、蘆丁，因此相關(guān)的結(jié)果與以往研究相一致［19-20］。然而，F(xiàn)ruitflow 經(jīng)ROS 調(diào)控血小板氧化損傷的具體成分尚不清楚，仍需進(jìn)一步探討。

細(xì)胞內(nèi)自噬水平的降低，與CVD 的進(jìn)展相關(guān)［21］。這主要是因為自噬降低，細(xì)胞積累錯誤折疊的蛋白質(zhì)和功能異常的線粒體，進(jìn)一步加劇細(xì)胞損傷［5］。血小板自噬最早于2014年被報道，隨后研究也證實血小板自噬與其功能存在緊密聯(lián)系［4，7］。當(dāng)血小板自噬被抑制時，細(xì)胞凋亡增加，并且線粒體吞噬作為一種選擇性自噬，可以抑制氧化應(yīng)激或低氧條件下的血小板聚集［4］。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ruitflow可以促進(jìn)血小板LC3 Ⅱ/Ⅰ比值升高和p62 表達(dá)降低，首次證明了Fruitflow 可促進(jìn)血小板自噬［4］。這提示Fruitflow 可能通過調(diào)控自噬，發(fā)揮CVD預(yù)防作用。據(jù)報道，血小板自噬促進(jìn)細(xì)胞存活，特別是自噬通過自噬體形成隔離產(chǎn)生ROS 的受損線粒體［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ruitflow 可增強H2O2處理血小板的自噬。同時，使用自噬抑制劑3-MA 時，F(xiàn)ruitflow 升高H2O2處理血小板的線粒體膜電位被逆轉(zhuǎn)。這表明，F(xiàn)ruitflow 降低血小板內(nèi)的ROS 可能部分通過自噬小體吞噬受損線粒體。其他研究也表明Fruitflow含有的綠原酸、蘆丁可以通過促進(jìn)自噬，清除受損細(xì)胞器，減輕細(xì)胞損傷［22-23］。然而，F(xiàn)ruitflow 是否通過自噬調(diào)控其他血小板功能仍需進(jìn)一步研究。此外，血小板自噬表現(xiàn)為吞噬泡、自噬小體、自噬溶酶體的形成，至于Fruitflow 對血小板自噬過程中形態(tài)學(xué)的影響需要以后進(jìn)一步研究。

臨床研究表明Fruitflow 對血小板功能的抑制作用主要是通過降低GPⅡb/Ⅲa的活化和P-selectin的表達(dá)，這與其成分中所含的多酚和核苷具有提高cAMP 和cGMP 水平的潛在作用一致［11］。此外，近期的一項體外研究表明Fruitflow 抑制血小板聚集和活化與調(diào)控PI3K/Akt、MAPKs 分子機制相關(guān)［24］。然而，這些分子機制是否參與Fruitflow 調(diào)控自噬、氧化應(yīng)激，仍需進(jìn)一步探究。

Fruitflow 的歐洲食品安全局（European Food Safety Authority）推薦的每日攝入量為150 mg，并且藥代動力學(xué)實驗表明，志愿者攝入150 mg Fruitflow后，產(chǎn)生的最大理論循環(huán)濃度約為43 mg/L［11］。因此，我們的體外研究采用20、40、80 mg/L 的劑量，這與之前體外研究用于抑制血小板聚集、活化的濃度相一致［24］。并且，多項人群研究結(jié)果表明150 mg/d 的Fruitflow 攝入不會產(chǎn)生肝腎功能損害和影響凝血時間。因此，F(xiàn)ruitflow 具有較好的安全性。

綜上所述，本研究表明Fruitflow 可通過促進(jìn)血小板的自噬功能從而減輕H2O2導(dǎo)致的血小板氧化損傷。因此，本研究為Fruitflow 在心血管疾病的營養(yǎng)膳食干預(yù)防治提供了理論依據(jù)，具有重要應(yīng)用價值。