簡正陽，陳佳敏，劉 秀，賀 青

（1.中山大學附屬第六醫(yī)院臨床營養(yǎng)科，廣東廣州 510610；2.中山大學附屬第六醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東廣州 510610；3.中山大學中山醫(yī)學院藥理教研室，廣東廣州 510080）

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是一種慢性和復發(fā)性胃腸道炎癥性疾病，主要包括克羅恩病（Crohn′s disease，CD）和潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）。我國IBD 的發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢［1］。IBD的發(fā)病機制與嚴重程度受到多種因素影響，其中主要包括遺傳因素、免疫反應、腸道菌群和氧化應激等［2］。目前治療IBD 的藥物包括氨基水楊酸（美沙拉秦）、皮質(zhì)類固醇、生物制劑和免疫抑制劑等，主要通過抑制炎癥發(fā)揮作用，存在價格昂貴、副作用多、部分患者療效不佳、不能根治等不足。因此，尋找更為安全有效的治療藥物是IBD研究的熱點之一。IBD的突出特征之一是腸道菌群的改變［3］，包括：腸道菌群的多樣性下降，變形菌門增加特別是侵襲性大腸桿菌等致病菌占比增高，有益菌屬（擬桿菌屬、乳桿菌屬和真桿菌屬等）顯著減少。補充有益菌或者針對性的補充IBD患者缺乏的菌群可能有助于IBD的治療。益生菌是通過定殖在人體內(nèi)，改變宿主某一部位菌群組成的一類對宿主有益的活性微生物。益生菌主要包括乳酸桿菌、雙歧桿菌、糞腸球菌以及不斷被發(fā)現(xiàn)的新有益菌株，已有的基礎(chǔ)研究和臨床研究發(fā)現(xiàn)益生菌在胃腸道疾病、自閉癥、阿爾茲海默癥、代謝綜合征等疾病有一定的治療功效［4］，部分菌株對疾病的治療有較顯著的效果［5］，其作用機制包括改善腸道微生態(tài)平衡、修復腸黏膜屏障、抑制腸粘膜炎癥［6-8］等。但是目前尚無明確可替代現(xiàn)階段一線治療藥物的益生菌株用于臨床治療IBD。因此，需要尋找高效安全的益生菌株作為IBD 的治療新選擇。本課題組與華大基因公司合作，通過比較IBD 患者與健康個體腸道菌群的差異，并分析了經(jīng)腸內(nèi)營養(yǎng)治療的IBD 患者以及三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzenesulfonic acid solution，TNBS）誘導的IBD 小鼠腸道菌群的變化，找出了改變突出的益生菌［9-10］，通過篩選，分離制備出具有顯著抗炎作用的益生菌加氏乳桿菌TF08-1（lactobacillus gasseri TF08-1），并進行了毒理實驗，確認了安全性。為進一步明確加氏乳桿菌TF08-1對于IBD的作用及其機制，本實驗以葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium salt，DSS）誘導的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型為對象，美沙拉秦作為陽性對照治療的藥物，分析加氏乳桿菌TF08-1對潰瘍性結(jié)腸炎的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗動物 24 只雄性5～8 周齡C57BL/6N 小鼠，SPF 級，體質(zhì)量20～25 g，購于北京維通利華有限公司【許可證號：SCXK（京）2016-0006】，飼養(yǎng)于中山大學實驗動物中心，環(huán)境溫度（25±3）℃，濕度（55±5）%以及12 h 光/暗循環(huán)，許可證號：SYXK（粵）2017-0081。本研究符合國家科學技術(shù)委員會頒布的《實驗動物管理條例》以及國家醫(yī)藥管理局頒布的《實驗動物管理實施細則》，涉及的所有內(nèi)容符合中山大學倫理委員會要求。

1.1.2 主要試劑 加氏乳桿菌TF08-1 經(jīng)復蘇培養(yǎng)制備成含有1×1010CFU/mL 菌液，4 ℃保存?zhèn)溆茫籑RS培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，美沙拉秦購自美侖生物技術(shù)有限公司，DSS 購自MP Biomedicals 公司，隱血試劑盒購自廣州吉捷生物科技有限公司，TUNEL 凋亡檢測試劑盒購自Sigma-Aldrich 公司，IL-10 ELISA 試劑盒購自博士德生物有限公司，TNF-αELISA 試劑盒購自欣博盛生物有限公司，BCA 試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，Bcl-2、GAPDH 一抗、二抗購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.1.3 實驗儀器 Western blot 制膠板、Western blot 電泳轉(zhuǎn)槽（美國Bio Rad 公司），Western blot 熒光感應曝光機（美國Odyssey 公司），酶標儀（奧地利TECAN公司），激光掃描共聚焦顯微鏡（日本Nikon）。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的活化 將保存于4 ℃的加氏乳桿菌TF08-1 以20 g/L 的接種量接種在MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，連續(xù)培養(yǎng)兩代后備用。

1.2.2 葡聚糖硫酸鈉誘導腸炎模型 將24 只8 周齡C57BL/6N 小鼠隨機分為4 組，每組6 只，即對照組（Control 組）、模型組（DSS 組）、美沙拉秦組（5-ASA+DSS 組）、加氏乳桿菌組（TF08-1+DSS 組）。適應性飼養(yǎng)1 周后，對照組小鼠自由飲水，其余各組飲用水換為含有30 g/L DSS 的飲用水自由飲用7 d誘導小鼠IBD模型［11］。對照組及模型組每天用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）灌胃0.2 mL/d，美沙拉秦組將美沙拉秦溶于PBS 中，按30 mg/kg 灌胃小鼠，加氏乳桿菌TF08-1組按2×109CFU灌胃，其余飼養(yǎng)條件如溫度、濕度、光照、飼料均一致，每天監(jiān)測體質(zhì)量，大便性狀以及大便隱血情況，第8 天處死小鼠，整個實驗過程持續(xù)1周。

1.2.3 小鼠一般情況評估 在小鼠給藥期間，每日記錄小鼠體質(zhì)量變化、活動狀態(tài)、糞便狀態(tài)和便血情況等，按照文獻所述的方法進行腸炎疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）評分并統(tǒng)計［12］。造模7 d后處死小鼠，立即取出結(jié)腸，測量盲腸末端和近端直腸之間的結(jié)腸長度。

1.2.4 組織病理學分析 小鼠處死后，于肛門上1 cm 處取長約1.5 cm 的小鼠結(jié)腸組織，縱行剖開后采用40 g/L 多聚甲醛溶液脫水固定，室溫靜置24 h后用不同濃度乙醇溶液梯度脫水，二甲苯透明處理，最后進行石蠟包埋。并用石蠟切片機將組織沿著腸軸縱行切成4 mm 厚度切片貼于載玻片上。用蘇木精染色后，經(jīng)過漂洗脫水后，用酒精伊紅染色液染色，經(jīng)過純酒精脫水，浸泡二甲苯使之透明，中性樹脂封片后于光學顯微鏡下觀察腸道病理改變并拍照。根據(jù)IBD 病理評分標準對每張病理切片進行評分［13］，記錄并統(tǒng)計評分結(jié)果。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附法檢測腸組織炎癥細胞因子 于肛門上2.5 cm 處取腸組織，用預冷的PBS 中清洗血液，稱取腸壁組織20 mg，加入180 μL 磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS；質(zhì)量體積比1：9），用眼科剪于冰上剪碎組織塊，并于冰上研磨。超聲機超聲勻漿后，離心機4 ℃，3 000 r/min（r=7 cm），離心15 min，將離心過的勻漿液去沉淀，留上清。將上清凍存于-80 ℃。利用BCA 蛋白濃度測定試劑盒（碧云天），復溫溶解后測定蛋白質(zhì)濃度，并根據(jù)總蛋白質(zhì)濃度稀釋到相應的倍數(shù)。然后利用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒，嚴格按照說明書測定IL-10 和TNF-α 的濃度，最終根據(jù)總蛋白濃度計算出單位體積的蛋白質(zhì)中IL-10 和TNF-α的濃度。

1.2.6 蛋白免疫印跡 處死小鼠后在距肛門上0.5 cm 處取新鮮結(jié)腸組織20 mg，加入300 μL 蛋白裂解液后剪碎后超聲裂解勻漿，4 ℃冰箱靜置30 min。置于4 ℃離心機12 000 r/min（r=7 cm）離心30 min 取上清。用BCA 法檢測所提取蛋白的總濃度，根據(jù)檢測濃度將蛋白樣品稀釋成等體積等濃度蛋白樣品，按4：1 加入Loading Buffer 后混勻98 ℃水浴變性5 min，-80 ℃冰箱保存。配制12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白，以400 mA 的恒流下轉(zhuǎn)膜1.5 h，然后用體積分數(shù)5%牛血清白蛋白封閉液室溫下封閉PVDF 膜1 h。封閉結(jié)束后，TBST清洗，將相應的條帶放入稀釋的BCL-2 或GAPDH稀釋液中，4 ℃孵育過夜，用TBST 清洗后再置于相應的二抗稀釋液中常溫孵育2 h，滴加顯影液，顯影并采集圖像。

1.2.7 結(jié)腸細胞凋亡檢測 取冰凍切片，37 ℃溫箱孵育1 h，用PBS 溶液清洗OCT 膠，并將切片浸入枸櫞酸溶液室溫靜置8 min。PBS 清洗后用TUNEL試劑盒按照說明書進行凋亡細胞染色，再用PBS清洗后滴加DAPI 室溫孵育5 min，PBS 漂洗，用抗熒光淬滅封片劑（含DAPI）封片。將切片置于激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并采集圖像。

1.2.8 統(tǒng)計學處理 本實驗所有數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計分析，采用GrapPad Prism 8.0 畫圖，滿足正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，結(jié)腸長度，組織病理評分，炎性因子水平，Bcl-2 表達量經(jīng)過正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗確認為服從正態(tài)分布且方差齊后，采用單因素方差分析（One way-ANOVA），多組比較有統(tǒng)計學意義后采用Dunnett’st檢驗進行兩兩比較，所有統(tǒng)計學分析均為雙側(cè)檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 加氏乳桿菌抑制葡聚糖硫酸鈉誘導的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的炎癥表現(xiàn)

30 g/L DSS誘導潰瘍性結(jié)腸炎后，模型組、加氏乳桿菌組和美沙拉秦組小鼠體質(zhì)量在第4 天均明顯下降，之后加氏乳桿菌組和美沙拉秦組下降速度均慢于模型組（圖1A）；模型組、加氏乳桿菌組和美沙拉秦組DAI 評分在DSS 誘導后逐日升高，加氏乳桿菌組和美沙拉秦組DAI 評分均低于模型組（圖1B）；處死小鼠后，模型組、加氏乳桿菌組和美沙拉秦組小鼠結(jié)腸明顯縮短，與模型組比較，加氏乳桿菌組和美沙拉秦組結(jié)腸長度縮短程度較輕，單因素方差分析結(jié)果顯示：各組間差異具有統(tǒng)計學意義（F=10.98，P=0.000 2）。組間兩兩比較顯示：與模型組［（6.28 ±0.36）cm］相比，加氏乳桿菌組［（7.74±0.29）cm］和美沙拉秦組［（7.22±0.71）cm］結(jié)腸結(jié)腸縮短程度均減輕，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.001；圖1C）；加氏乳桿菌組體質(zhì)量下降程度、DSS 評分和結(jié)腸縮短程度雖均優(yōu)于美沙拉秦組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 加氏乳桿菌緩解葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠結(jié)腸組織損傷

小鼠結(jié)腸組織HE 染色后鏡下觀察和進行評分。鏡下觀察，對照組結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，無炎性細胞浸潤（圖2A）；模型組有明顯炎性細胞浸潤，上皮細胞大量脫落，肌層變厚（圖2B）；加氏乳桿菌組和美沙拉秦組病理損傷較輕，腺體結(jié)構(gòu)并未完全消失，炎性細胞浸潤程度較淺，上皮層細胞尚存（圖2C、D）。結(jié)腸組織病理學評分采用單因素方差分析，結(jié)果顯示：各組間差異具有統(tǒng)計學意義（F=10.12，P=0.001 6），組間兩兩比較顯示：美沙拉秦組（3.67±2.25）、加氏乳桿菌組（2.83±1.94）與模型組（7.17±0.75）相比明顯有所下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05；P＜0.05）。加氏乳桿菌炎癥程度略輕于美沙拉秦組，但是兩組結(jié)腸組織損傷差異并無統(tǒng)計學意義（P=0.79；圖2E）。

2.3 加氏乳桿菌抑制葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠結(jié)腸組織炎性細胞因子分泌

各組小鼠結(jié)腸組織中IL-10、TNF-α 促炎細胞因子的水平經(jīng)ELISA 試劑盒檢測后。小鼠結(jié)腸組織中的IL-10 水平經(jīng)單因素方差分析結(jié)果顯示：各組間差異具有統(tǒng)計學意義（F=5.53，P=0.017）。組間兩兩比較采取Dunnettt檢驗分析，結(jié)果顯示：和對照組比較，模型組結(jié)腸組織中IL-10 水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義［（95.01±53.73）pg/mLvs.（277.33±64.63）pg/mL，P＜0.05］，美沙拉秦組和模型組比較，IL-10水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義［（121.32±72.72）pg/mLvs.（277.33±64.63）pg/mL，P＜0.05］，加氏乳桿菌組和模型組比較，IL-10水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義［（156.21±97.19）pg/mLvs.（277.33±64.63）pg/mL，P＜0.05］。加氏乳桿菌組和美沙拉秦組IL-10 含量比較，差異無統(tǒng)計學意義［（156.21±97.19）pg/mLvs.（121.32±72.72）pg/mL，P=0.50；圖3A］。小鼠結(jié)腸組織中的TNF-α 水平經(jīng)單因素方差分析結(jié)果顯示：各組間差異具有統(tǒng)計學意義（F=5.32，P=0.019）。組間兩兩比較采取Dunnettt檢驗分析，結(jié)果顯示：和對照組比較，模型組結(jié)腸組織中TNF-α 水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義［（315.07±218.42）pg/mLvs.（691.02±239.81）pg/mL，P＜0.05］，美沙拉秦組和模型組比較，TNF-α 水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義［（411.19±81.33）pg/mLvs.（691.02±239.81）pg/mL，P＜0.05］，加氏乳桿菌組和模型組比較，TNF-α 水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義［（438.46±117.20）pg/mLvs.（691.02±239.81）pg/mL，P＜0.05］。加氏乳桿菌組和美沙拉秦組TNF-α含量比較，差異無統(tǒng)計學意義［（438.46±117.20）pg/mLvs.（411.19±81.33）pg/mL，P=0.65；圖3B］。

圖2 小鼠結(jié)腸組織病理染色和分析Fig.2 Histopathological changes of colons in each group

2.4 加氏乳桿菌上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白的表達

Western blot 結(jié)果經(jīng)單因素方差分析顯示：各組間差異具有統(tǒng)計學意義（F=10.05，P=0.004 3）。組間兩兩比較采取Dunnettt檢驗分析，結(jié)果顯示：美沙拉秦組Bcl-2 表達量升高，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05；圖4）。加氏乳桿菌組Bcl-2 表達量升高，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05；圖4）。加氏乳桿菌組和美沙拉秦組蛋白表達量比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖3 小鼠腸組織細胞因子IL-10、TNF-α表達量Fig.3 Expression levels of cytokines IL-10 and TNF-α in intestinal tissues of mice

圖4 小鼠腸組織Bcl-2表達量Fig.4 The expression level of Bcl-2 in intestinal tissues of mice

2.5 加氏乳桿菌對葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠腸道細胞凋亡的影響。

結(jié)腸組織冰凍切片后采用TUNEL 染色檢測組織凋亡情況，結(jié)果顯示，模型組和對照組相比，腸組織黏膜綠色凋亡細胞顯著增加，加氏乳桿菌組和美沙拉秦組綠色凋亡的細胞明顯減少（圖5）。

圖5 小鼠腸組織TUNEL染色Fig.5 TUNEL staining of mouse intestinal tissue

3 討論

炎癥性腸病是一種主要累及整個消化道的慢性非特異性炎性疾?。?4-15］，嚴重時可并發(fā)消化道穿孔、大出血、中毒性巨結(jié)腸和腫瘤，目前尚無法治愈，藥物和手術(shù)治療的預后均不理想。因此尋找新的IBD 治療方案尤為重要。益生菌作為對人體有益的活性微生物制劑，在用于治療IBD 的相關(guān)研究中一直備受關(guān)注，臨床研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌Nissle 1917 在誘導和維持UC 緩解方面作用接近美沙拉秦［16-17］。Tursi［18］報道了復合益生菌VSL#3 作為標準藥物治療的輔助劑，可以緩解輕中度UC 復發(fā)患者的病情，但是對于重度患者效果較差。這些均證明益生菌在IBD 的治療上具有廣闊前景，需要研發(fā)更為有效的益生菌株。

加氏乳桿菌TF08-1是我們和華大基因共同研發(fā)分離的新型益生菌，具有良好的抗炎效果。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在DSS誘導小鼠潰瘍性結(jié)腸炎疾病模型中，小鼠出現(xiàn)明顯體質(zhì)量下降、血便、結(jié)腸縮短，組織病理切片發(fā)現(xiàn)腸黏膜正常結(jié)構(gòu)消失，大量炎性細胞浸潤，加氏乳桿菌TF08-1 能抑制潰瘍性結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量下降趨勢，降低DAI 評分，改善結(jié)腸病理損傷。美沙拉秦作為UC 的一線治療藥物，雖然對于重度的UC 往往無效，對于輕中度的UC 能夠減輕炎癥、誘導黏膜愈合。在本研究中加氏乳桿菌TF08-1 效果與美沙拉秦相當，提示加氏乳桿菌TF08-1 對DSS 誘導的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎具有緩解作用。遺傳和免疫學研究表明，細胞炎性因子直接參與了IBD 的發(fā)病機理，在調(diào)控腸道炎癥和IBD 相關(guān)的臨床癥狀中起著重要的作用［19］，在IBD的小鼠模型中研究發(fā)現(xiàn)，可通過調(diào)節(jié)細胞因子功能進而治療IBD［20］。例如，TNF-α 的阻斷已經(jīng)在臨床上用于治療IBD［21］，因此，我們檢測了結(jié)腸組織中IL-10 和TNF-α 水平，加氏乳桿菌TF08-1 可顯著下調(diào)DSS 鼠的IL-10 和TNF-α 水平，與美沙拉秦治療組比較差異無統(tǒng)計學意義，可以認為加氏乳桿菌TF08-1 具有良好的抗炎作用，作用效果接近美沙拉秦。

腸粘膜細胞的異常死亡是炎癥性腸病的發(fā)病機制之一，腸黏膜細胞死亡方式包括凋亡、失巢凋亡、細胞焦亡、壞死性死亡等［22］，腸粘膜細胞的異常凋亡與IBD 炎癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［23］，本研究首先通過檢測腸組織凋亡抑制蛋白B 淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）表達量，發(fā)現(xiàn)DSS 誘導的模型鼠腸組織Bcl-2 表達量明顯下降，加氏乳桿菌組Bcl-2 表達量明顯增高，且差異具有統(tǒng)計學意義，表明腸黏膜組織細胞凋亡水平受到明顯抑制，其結(jié)果與美沙拉秦組相當。TUNEL 染色結(jié)果顯示，DSS誘導的模型組腸黏膜細胞凋亡細胞明顯增多，這表明腸粘膜細胞的凋亡在IBD 的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，加氏乳桿菌組腸黏膜細胞凋亡明顯降低，尤其腸黏膜上皮細胞凋亡明顯減少，其結(jié)果與美沙拉秦組相當，這表明加氏乳桿菌可能通過抑制腸黏膜細胞凋亡進而緩解IBD 表現(xiàn)。這些結(jié)果表明加氏乳桿菌TF08-1 和美沙拉秦均可緩解小鼠潰瘍性結(jié)腸炎，且療效相近，其機制可能與抑制腸上皮細胞凋亡相關(guān)。

本研究尚存在以下不足，首先，經(jīng)過加氏乳桿菌TF08-1 干預后TNF-α 水平降低，表明結(jié)腸炎癥得到了很好的抑制，但是抗炎因子IL-10 經(jīng)過干預后也同步降低，這提示加氏乳桿菌可能通過其他炎性因子調(diào)控結(jié)腸炎［24-26］。在后續(xù)研究中需要進一步檢測血清、組織中各類炎性因子水平，進一步明確其在炎性調(diào)控中的作用。其次，目前本研究發(fā)現(xiàn)加氏乳桿菌TF08-1的緩解潰瘍性結(jié)腸炎的作用機制可能與線粒體通路介導的凋亡相關(guān)，但是需要用特異性信號通路抑制劑進一步進行實驗驗證。最后，TF08-1 還可能影響腸道其他的微生物及黏膜屏障，尚需要進一步試驗進行驗證。我們將在后續(xù)研究中擴大樣本量，進一步通過急性炎癥模型和慢性炎癥模型探究加氏乳桿菌對UC 的療效及其機制。

綜上所述，本研究證明加氏乳桿菌TF08-1 可以改善DSS誘導的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎，且療效接近美沙拉秦，其作用機制可能與抑制腸黏膜細胞凋亡相關(guān)。本研究證明了一個新型菌株的有效性，口服益生菌或可作為IBD治療的有效手段之一。