鄧藝雯，張寅航，徐興浩，蟻焌哲，張小然，黃瑋俊

（中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞與組織工程研究中心，廣東廣州 510080）

［J SUN Yat-sen Univ（Med Sci），2021，42（3）：346-354］

抑郁癥（depressive disorder）是一種常見(jiàn)的精神類(lèi)疾病，核心癥狀是情感低落（depressed mood）、興趣減退或快感缺失（anhedonia）。此外，還可伴有精力減退、易怒、注意力障礙、食欲下降、睡眠和認(rèn)知障礙能力下降等癥狀，嚴(yán)重者常反復(fù)出現(xiàn)消極的自殺觀念和行為［1］。流行病學(xué)調(diào)查顯示，抑制癥還與Ⅱ型糖尿病、冠脈系統(tǒng)疾病、骨質(zhì)疏松、腸易激綜合征、癌癥、帕金森病、癡呆、癲癇等多種常見(jiàn)疾病的發(fā)病密切相關(guān)［2-9］，影響著世界約16%人口的健康［10］。抑郁癥嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，它的病因?qū)W和影響因素的探究因而成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。一般認(rèn)為應(yīng)激，特別是慢性應(yīng)激，是誘發(fā)抑郁癥的重要環(huán)境危險(xiǎn)因子之一。據(jù)報(bào)導(dǎo)，慢性應(yīng)激可降低前額皮質(zhì)神經(jīng)元的神經(jīng)遞質(zhì)受體的敏感性，誘發(fā)神經(jīng)元的活性受損［11］；過(guò)度激活中腦腹側(cè)被蓋區(qū)的多巴胺能神經(jīng)元［12］；抑制海馬區(qū)神經(jīng)元的神經(jīng)遞質(zhì)分泌，改變神經(jīng)元的突觸結(jié)構(gòu)，加速神經(jīng)元的萎縮［11，13］。上述中樞核團(tuán)的功能和器質(zhì)性病損，正是抑郁癥發(fā)病的重要病理學(xué)基礎(chǔ)。建立抑郁癥的動(dòng)物模型是慢性應(yīng)激導(dǎo)致抑郁癥具體機(jī)制研究的關(guān)鍵一環(huán)。目前最常用的造模方式是使用慢性溫和不可預(yù)見(jiàn)性的刺激（chronic unpredicted mild stress，CUMS），模擬慢性應(yīng)激［14］。這種方法造模的成功率不高，造模的效果也不甚穩(wěn)定［15-16］。因?yàn)檠铀韪雇鈧?cè)區(qū)頭端（rostral ventrolateral medulla，RVLM）是中樞在應(yīng)激中調(diào)節(jié)外周交感神經(jīng)系統(tǒng)的核心部位［17］，所以我們使用化學(xué)遺傳技術(shù)，對(duì)小鼠RVLM 進(jìn)行持續(xù)的刺激，模擬機(jī)體對(duì)慢性應(yīng)激的反應(yīng)，系統(tǒng)觀察小鼠的行為學(xué)、血壓及主要炎癥因子的變化情況，為優(yōu)化慢性應(yīng)激誘發(fā)抑郁癥的動(dòng)物建模方法提供參考。現(xiàn)將結(jié)果介紹如下。

1 材料與方法

1.1 RVLM腦區(qū)化學(xué)遺傳小鼠的建立

SPF 級(jí)雄性Dbh-cre 純合子C57/BL6 小鼠，10～12周齡，體質(zhì)量22～26 g，飼養(yǎng)在中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（23±2）℃，濕度為（50±5）%，自由攝取食物和飲水，自然晝夜節(jié)律，新到動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。為降低個(gè)體差異對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，首先用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，取得分接近的30 只小鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)規(guī)定。

使用異氟烷麻醉后，將小鼠以俯臥位置于腦立體定位儀上，確定注射部位RVLM 的立體定向坐標(biāo)，以電動(dòng)磨鉆穿透相應(yīng)腦區(qū)表面顱骨形成直徑約1.5 mm 的孔洞，用微量注射泵及1 μL 的Hamilton微注射器在小鼠的雙側(cè)RVLM 注射腺病毒載體AAV2/9-hSyn-DIO-hM3D（Gq）-mCherry（造模組）或AAV2/9-hSyn-DIO-mCherry（對(duì)照組）300 μL（Taitools，中國(guó)），勻速10 min 注射完畢，注射后留針5 min。操作過(guò)程中，在小鼠身體下方放置加熱墊，使小鼠體溫維持在（37.0±0.5）℃。每天定時(shí)予造模小鼠經(jīng)腹腔注射給藥氯氮平N-氧化物（clozapine N-oxide，CNO）溶液，具體流程為每天給藥1次（給藥量為1mg/kg），共2 周，以提高神經(jīng)元的敏感性；再每天給藥3 次，共2 周，以強(qiáng)化神經(jīng)元的興奮效果（圖1A）。完成造模流程后，我們進(jìn)行后續(xù)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.2 小鼠的血壓檢測(cè)

使用BP-98A 大小鼠無(wú)創(chuàng)血壓儀（softron，日本），用尾壓光電容積脈波測(cè)量法間接無(wú)創(chuàng)測(cè)量老鼠的血壓和心率的記錄。測(cè)量時(shí)，取連續(xù)測(cè)量5～8次的收縮壓和心率值，求其平均值。

1.3 小鼠的曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

將小鼠放入由不透明材料制成的長(zhǎng)寬高為50 cm×50 cm × 50 cm，周壁、箱底為藍(lán)色的敞箱內(nèi)，曠場(chǎng)區(qū)域被等分為16 格，其中中央4 格定義為中心區(qū)，其余為外圍區(qū)，實(shí)驗(yàn)時(shí)保證區(qū)域四角光線(xiàn)均勻。視頻記錄10 min 內(nèi)小鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱中的活動(dòng)。每只動(dòng)物只進(jìn)行1 次行為測(cè)定測(cè)定指標(biāo)；水平運(yùn)動(dòng)總距離、中央?yún)^(qū)進(jìn)入總次數(shù)、中央?yún)^(qū)滯留時(shí)間和中央?yún)^(qū)域運(yùn)動(dòng)距離。

1.4 小鼠的蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)

在隔噪音、安靜的房間內(nèi)給予每只小鼠事先定量好的水瓶，并于24 h后稱(chēng)重計(jì)算液體消耗量。第1 個(gè)24 h，測(cè)定動(dòng)物正常飲水量；第2 個(gè)24 h 測(cè)試含糖飲水；第3 個(gè)24 h 測(cè)試含糖飲水。排除位置偏好干擾，計(jì)算動(dòng)物的蔗糖水偏好百分比（糖水偏愛(ài)=糖水消耗/總液體消耗×100%）。

1.5 小鼠的轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)主要測(cè)定小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力。先以較低轉(zhuǎn)速（10 r/min，）對(duì)所有實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練以消除恐懼感，每天3 次，每次5 min，間隔時(shí)間10 min 以上，連續(xù)3 d。第4 天正式實(shí)驗(yàn)，將小鼠放在轉(zhuǎn)棒儀上，轉(zhuǎn)速?gòu)?2 r/min 開(kāi)始，在6 min 內(nèi)加速到25 r/min，利用轉(zhuǎn)棒儀的分析軟件自動(dòng)記錄每只小鼠從開(kāi)始到從轉(zhuǎn)動(dòng)棒上掉落下來(lái)的時(shí)間，即為轉(zhuǎn)棒潛伏期時(shí)間。連續(xù)進(jìn)行3 次試驗(yàn)（間隔10 min），取最長(zhǎng)時(shí)間并記錄。

1.6 小鼠的強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)

測(cè)定指標(biāo)為不動(dòng)時(shí)間，即在水面漂浮、只有維持身體平衡必備的輕微活動(dòng)或是身體垂直于水面只有鼻露出水面的時(shí)間記錄為不動(dòng)時(shí)間。首先向4 L 燒杯內(nèi)注入溫度為（23±2）℃，深約20 cm 的水，使小鼠在水中尾部不能觸碰杯底。每只小鼠單獨(dú)測(cè)試。每次強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的總時(shí)間為6 min。測(cè)試時(shí)將小鼠輕放入水中，首先讓其適應(yīng)游泳2 min，從第2 min 開(kāi)始記錄后續(xù)4 min 內(nèi)小鼠在水中停止掙扎、呈漂浮狀態(tài)的時(shí)間總和。

1.7 小鼠外周血主要炎性因子的檢測(cè)

眼眶后靜脈叢取血，常溫靜置30 min，1 500×g離心10 min 后取25 μL 血清，用LEGENDPlex Mouse Inflammation Panel 試劑盒（BioLegend，德國(guó)），按照制造商提供的說(shuō)明書(shū)，通過(guò)流式細(xì)胞儀（BECKMAN COULTER，美國(guó)）測(cè)量炎性因子濃度。所獲數(shù)據(jù)使用LEGENDplex 數(shù)據(jù)分析軟件（BioLegend，德國(guó)）進(jìn)行分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行處理，P＜0.05 則認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 RVLM腦區(qū)化學(xué)遺傳小鼠的成功建立

立體定位注射表達(dá)載體3周后取7只小鼠進(jìn)行血壓和腦片檢測(cè)，判斷RVLM 腦區(qū)化學(xué)遺傳小鼠是否成功建立。檢測(cè)結(jié)果如圖1C所示，7只小鼠的雙側(cè)RVLM 腦區(qū)均特異性表達(dá)紅色熒光，提示M3D（Gq）和mCherry 紅色熒光蛋白在RVLM 去甲腎上腺能神經(jīng)元中穩(wěn)定表達(dá)。經(jīng)腹腔向小鼠注射CNO（Clozapine N-oxide，給藥量為1 mg/kg）溶液后1 h，檢測(cè)小鼠的血壓及心律。結(jié)果顯示，對(duì)照組的心率（HR）、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）和平均脈壓（MBP）分別是（489.8±61.49）次/min、（102.8±7.45）mmHg、（50.44±10.17）mmHg 和（67.91±7.45）mmHg，造模組則為（473.0±123.40）次/ min、（115±12.81）mmHg、（68.78±11.53）mmHg 和（84.2±11.67）mmHg。其中，造模組的舒張壓（P＜0.01）和平均脈壓差（P＜0.01）與對(duì)照組比均顯著升高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1D）。結(jié)果提示造模小鼠的RVLM 去甲腎上腺能神經(jīng)元成功被CNO激活。

圖1 RVLM腦區(qū)化學(xué)遺傳小鼠的成功建立Fig.1 Chemical genetic mice of RVLM were established successfully

2.2 RVLM 腦區(qū)化學(xué)遺傳小鼠持續(xù)給藥后的曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)變化

結(jié)果如圖2-B、C所示，造模組的水平運(yùn)動(dòng)總距離（P＜0.001）、中央?yún)^(qū)進(jìn)入總次數(shù)（P＜0.001）、中央?yún)^(qū)滯留時(shí)間（P＜0.001）和中央?yún)^(qū)域運(yùn)動(dòng)距離（P＜0.001）與對(duì)照組比均顯著降低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)照組的水平運(yùn)動(dòng)總距離、中央?yún)^(qū)進(jìn)入總次數(shù)、中央?yún)^(qū)滯留時(shí)間和中央?yún)^(qū)域運(yùn)動(dòng)距離分別是（26199±4613）mm、（27.1±7.34）s、（71.5±25.9）次和（3376±601.8）mm，造模組則為（6561±3239）mm、（2.63±1.51）s、（9.52±6.645）次和（529±532.4）mm。結(jié)果提示，造模小鼠出現(xiàn)了探索和運(yùn)動(dòng)能力減退的抑郁癥典型癥狀。

圖2 造模小鼠的曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的行為學(xué)變化Fig.2 Behavioral changes of model mice in open field experiment

2.3 RVLM 腦區(qū)化學(xué)遺傳小鼠持續(xù)給藥后的蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)變化

結(jié)果如圖3 所示，造模組的蔗糖水偏好系數(shù)與對(duì)照組比均顯著降低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。對(duì)照組的基線(xiàn)總液體消耗量、蔗糖水消耗量、純水消耗量和蔗糖水偏好系數(shù)分別是（54.74±6.17）g、（54.39±1.06）g、（2.71±1.72）g 和（0.95±0.035）%，造模組則為（56.16±7.07）g、（42.84±11.04）g、（7.24±1.80）g 和（0.85±0.042）%。結(jié)果說(shuō)明造模組小鼠出現(xiàn)了明顯的快感缺失，這和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是一致的。

圖3 造模小鼠的蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)的行為學(xué)變化Fig.3 Behavioral changes of model mice in sucrose preference experiment

2.4 RVLM 腦區(qū)化學(xué)遺傳小鼠持續(xù)給藥后的轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)變化

轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)反映動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力。據(jù)報(bào)導(dǎo)，慢性應(yīng)激誘發(fā)的抑郁癥動(dòng)物模型會(huì)在轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)不佳［18］。因此，我們也進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖4 所示，對(duì)照組和造模組的轉(zhuǎn)棒潛伏時(shí)間分別為（366.8±55.2）s、（70.7±49.9）s。造模組小鼠的轉(zhuǎn)棒潛伏期時(shí)間明顯低于對(duì)照組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。這提示造模小鼠除了出現(xiàn)抑郁癥2 大典型癥狀外，還出現(xiàn)了運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力的減退。

圖4 造模小鼠的轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)的行為學(xué)變化Fig.4 Behavioral changes of model mice in rotarod experiment

2.5 RVLM 腦區(qū)化學(xué)遺傳小鼠持續(xù)給藥后的強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)變化

強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中小鼠靜止?fàn)顟B(tài)持續(xù)的時(shí)間越長(zhǎng)，提示小鼠的抑郁癥程度越嚴(yán)重［19］。如圖5 所示，對(duì)照組和造模組的靜止?fàn)顟B(tài)持續(xù)時(shí)間分別為（173.2±64.8）s、（185.2±35.6）s，造模組的靜止時(shí)間較對(duì)照組的絕對(duì)差值在（12.0±26.4）s。結(jié)果顯示造模組的靜止時(shí)間較對(duì)照組稍有增多，但差異并不顯著，組間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖5 造模小鼠的強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的行為學(xué)變化Fig.5 Behavioral changes of model mice in forced swimming experiment

2.6 RVLM 腦區(qū)化學(xué)遺傳小鼠持續(xù)給藥后的血壓變化

慢性應(yīng)激誘發(fā)的抑郁癥會(huì)伴有血壓偏高［20］。完成造模流程后，我們觀察造模小鼠的心率和血壓情況，結(jié)果如圖6A 所示，對(duì)照組的心率（HR）、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）和平均脈壓差（MBP）分別是（470.2±55.82）次/ min、（104.4±8.168）mmHg、（54.15±1.485）mmHg 和（72.03±1.73）mmHg，造模組則為（604.1±37.33）次/ min、（114.2±8.241）mmHg、（62.05±6.10）mmHg和（79.91±6.00）mmHg。其中，造模組的心率（P＜0.01）、收縮壓（P＜0.05）、舒張壓（P＜0.05）和平均脈壓差（P＜0.05）與對(duì)照組比均顯著升高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.7 RVLM 腦區(qū)化學(xué)遺傳小鼠持續(xù)給藥后的外周血主要炎性因子變化

慢性應(yīng)激誘發(fā)的抑郁癥還會(huì)伴有炎性因子的釋放紊亂［19-21］。因此我們檢測(cè)了機(jī)體外周血主要的炎性因子水平，這包括IFN-γ、TNF-α、IL1-β 和IL-10。結(jié)果顯示，對(duì)照組的這4 種炎性因子的濃度分別為（23.4±13.1）pg/mL、（22.3±6.6）pg/mL、（189.8±126.8）pg/mL、（552.3±393.6）pg/mL，造模組則分別為（190.0±100.2）pg/mL、（32.6±11.5）pg/mL、（163.3±87.8）pg/mL、（1508.2±531.6）pg/mL。造模組外周血的IFN-γ（P＜0.05）和IL-10（P＜0.05）濃度均比對(duì)照組顯著升高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6B）。

圖6 小鼠模型血壓和外周血炎性因子的變化Fig.6 The changes of blood pressure and inflammatory factors between the model and control group

3 討論

慢性溫和不可預(yù)見(jiàn)性的刺激（CUMS）法迄今已廣泛使用近30 年［14］。能較好的誘發(fā)動(dòng)物產(chǎn)生消極情緒、快感缺失等抑郁癥的經(jīng)典表現(xiàn)。有報(bào)導(dǎo)指出CUMS 法造模的成功率并不高，只有約30%［15-16，22］，因此，我們需要優(yōu)化造模方法，以求提高抑郁癥動(dòng)物建模的效率和穩(wěn)定性。

我們建立了基于化學(xué)遺傳的慢性應(yīng)激導(dǎo)致抑郁癥的小鼠模型，行為學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)絕大部分造模小鼠均表現(xiàn)出探索和運(yùn)動(dòng)能力減退、快感缺失等抑郁癥經(jīng)典表現(xiàn)，且較對(duì)照組的差異非常明顯。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)綜合反映了抑郁癥對(duì)動(dòng)物探索和運(yùn)動(dòng)能力的影響［23］，造模組小鼠較對(duì)照組在水平運(yùn)動(dòng)總距離、中央?yún)^(qū)進(jìn)入總次數(shù)、中央?yún)^(qū)滯留時(shí)間和中央?yún)^(qū)域運(yùn)動(dòng)距離這四項(xiàng)指標(biāo)均顯著下降（P＜0.001），轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)反映了抑郁癥對(duì)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力的影響［21］，蔗糖偏好實(shí)驗(yàn)反映了抑郁癥對(duì)動(dòng)物快感缺失程度的影響［20，24］。后2 個(gè)實(shí)驗(yàn)的核心指標(biāo)——轉(zhuǎn)棒潛伏時(shí)間（P＜0.001）和蔗糖水偏好系數(shù)（P＜0.001）均呈現(xiàn)與曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)一致的結(jié)果。據(jù)調(diào)查，蔗糖偏好或曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果在CUMS 法造模動(dòng)物中較為穩(wěn)定［14-16］，依然有至少25%的實(shí)驗(yàn)室報(bào)告說(shuō)這2 個(gè)實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性不佳［14-16］。我們?cè)炷５某晒β屎头€(wěn)定性在這2個(gè)實(shí)驗(yàn)均有較好的表現(xiàn)，較CUMS 法可能有一定的優(yōu)勢(shì)。在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中，雖然造模組的絕對(duì)靜止時(shí)間稍多于對(duì)照組，但差異并不顯著。這可能是因?yàn)槲覀兊脑炷r(shí)間還不夠長(zhǎng)所致。據(jù)報(bào)導(dǎo)，強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在CUMS 法造模動(dòng)物中表現(xiàn)也極不穩(wěn)定［14-16］。

慢性應(yīng)激誘發(fā)的抑郁癥往往伴有血壓偏高，外周血IFN-γ、TNF-α、IL1-β 等炎性因子增加，IL-10等抑炎因子減少等癥狀［19-21］。提示CUMS法造模動(dòng)物的炎性因子和血壓調(diào)節(jié)因子，如一氧化氮（NO）、血清素（serotonin）等合成發(fā)生紊亂的研究多有報(bào)導(dǎo)［25-29］。因此，我們?cè)谕瓿稍炷Ａ鞒毯笠灿^察了造模小鼠的血壓及炎性因子的改變情況。結(jié)果顯示，造模組的心率（P＜0.01）和血壓（P＜0.05）均較對(duì)照組顯著上調(diào)；炎性因子方面，造模組的IFN-γ（P＜0.01）和抑炎因子IL-10（P＜0.05）水平較對(duì)照組顯著上調(diào)。上述結(jié)果提示，我們的方法與CUMS 法一樣，可以誘發(fā)血壓偏高和炎性因子釋放紊亂等抑郁癥的常見(jiàn)伴隨癥狀。

綜上所述，我們建立了基于化學(xué)遺傳的慢性應(yīng)激導(dǎo)致抑郁癥小鼠模型，該模型在誘發(fā)抑郁癥經(jīng)典癥狀，及血壓偏高、炎性因子釋放紊亂等抑郁癥伴隨癥狀上均表現(xiàn)出較高的成功率和穩(wěn)定性。相關(guān)研究為優(yōu)化慢性應(yīng)激誘發(fā)抑郁癥的動(dòng)物模型建模方法，提高建模效率和穩(wěn)定性提供了有參考價(jià)值的科學(xué)依據(jù)。