阮 舒

（鹽城市第三人民醫(yī)院內分泌科，江蘇 鹽城 224001）

甲狀腺癌屬于臨床上常見疾病，與分化型甲狀腺癌相比，未分化型甲狀腺惡性腫瘤在甲狀腺癌中的占比為1%～2%，但患者預后往往較差，生存期較短，多數(shù)患者生存期不足5個月。去氫駱駝蓬（HM）可發(fā)揮抑菌、抗腫瘤等作用[1]。PI3K/AKT信號通路以及MAPK信號通路等在甲狀腺癌細胞的增殖、分化等過程中發(fā)揮重要作用[2]。有研究指出，HM能夠對甲狀腺癌未分化細胞化療過程中產(chǎn)生一定的影響[3]。目前，關于未分化型甲狀腺癌的研究較少。基于此，本研究主要從細胞層面探討HM對甲狀腺未分化癌細胞放療增敏中的作用，從而進一步為甲狀腺未分化癌治療方法的制訂提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 人未分化甲狀腺癌細胞、PI3K抑制劑LY294002、PI3K激動劑IGF-1均購自南京伯特仕生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CCK8法檢測HM對于TT細胞的抑制效果 取細胞，消化后形成細胞懸液，5×104個/mL左右，96孔板，每孔100 μL，分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h。在培養(yǎng)前1 h，加CCK8溶液，混勻，孵育1 h，檢測吸光度值。

1.2.2 免疫蛋白印跡試驗（Western blot）檢測HIF、PI3K、AKT、MAPK、GLUT、VEGF蛋白以及p-PI3K、p-AKT的表達 細胞接種，經(jīng)PBS清洗，培養(yǎng)，離心，取上清液。蛋白定量，蛋白樣本置于-20 ℃冰箱中，取出蛋白樣本，凝膠電泳，電轉移，過夜，加一抗、二抗，經(jīng)TBST清洗，曝光、顯影、成像。

1.2.3 實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測HIF、PI3K、AKT、MAPK、GLUT、VEGF mRNA的表達 取細胞懸液，離心，提取總RNA，反轉錄出cDNA。PCR擴增：94 ℃，40 s；48 ℃，30 s；72 ℃，40 s。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞的凋亡 取細胞，消化，6孔板，過夜，培養(yǎng)。24 h，PBS洗滌2次，70%乙醇固定，過夜培養(yǎng)。PBS，加入50 μg/mL的溴化乙錠和吖啶橙混合溶液以及10 μg/mL的R NaseA和0.2%Triton-100，避光環(huán)境孵育。采用流式細胞術進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料采用（）表示，組間比較行t檢驗；計數(shù)資料采用[n（%）]表示，組間比較行χ2檢驗；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HM對甲狀腺未分化癌細胞的影響 ①HM對于TT細胞具有濃度依賴性的殺傷效果見圖1。不同濃度的HM分別與TT細胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后均顯示出明顯的濃度依賴性的細胞抑制效果。②HM引起TT細胞凋亡的流式細胞儀結果：15 μmol/L、30 μmol/L、60 μmol/L的HM作用于TT細胞后流式細胞儀測定凋亡細胞比例，發(fā)現(xiàn)隨著濃度的逐漸增加，凋亡細胞的比例也逐漸增加，見圖2。③Western blot檢測結果：HM聯(lián)合放療組中HIF-α、PI3K、AKT、MAPK、GLUT、VEGF蛋白的表達低于單獨放療組，見圖3。④RT-PCR檢測結果：HM聯(lián)合放療組中HIF-α、PI3K、AKT、MAPK、GLUT、VEGF mRNA的表達低于單獨放療組，見圖4。

圖1 HM對TT細胞的抑制效果

圖2 不同濃度HM引起TT細胞凋亡的分析

圖3 Western blot檢測結果

圖4 RT-PCR檢測結果

2.2 過表達HIF-α對甲狀腺未分化癌細胞的影響 ①Western blot檢測結果：HM聯(lián)合放療組中HIF-α、PI3K、AKT、MAPK、GLUT、VEGF蛋白的表達高于單獨放療組。見表1。②RT-PCR檢測結果：HM聯(lián)合放療組中HIF-α、PI3K、AKT、MAPK、GLUT、VEGF mRNA的表達高于單獨放療組。見表2。

表1 兩組蛋白表達結果（）

表1 兩組蛋白表達結果（）

表2 兩組mRNA表達結果（）

表2 兩組mRNA表達結果（）

3 討 論

甲狀腺未分化癌作為惡性程度較高的一種類型，預后往往較差，病死率較高[4-6]。目前已有證據(jù)表明，綜合治療能提高甲狀腺未分化癌的局部控制率和存活率。放療作為綜合治療的一種，可緩解患者的癥狀，延長生存期，起到姑息治療的目的[7-8]。但由于存在嚴重的細胞乏氧現(xiàn)象，甲狀腺未分化癌對放療會產(chǎn)生抵抗，復發(fā)率較高。相關研究表明，甲狀腺癌的腫瘤細胞處于缺氧狀態(tài)，腫瘤細胞會激活一系列相關分子信號傳導途徑導致腫瘤細胞在適應乏氧微環(huán)境的同時，增強其侵襲性和對放化療的抗拒性，致使療效下降[9]。因而，這些信號傳導途徑中的相關分子及放射增敏成為腫瘤乏氧研究中的熱點。其中，乏氧誘導因子-1（HIF-1α）備受臨床的關注。相關研究指出，在細胞缺氧的環(huán)境下，HIF-1α存在多條信號通路介導其中，調控主要發(fā)生在2條信號途徑，即PI3K/Akt依賴的HIF-1α蛋白穩(wěn)定性調控、MEK/MAPK介導的HIF-1α反式激活功能調控[10]。

本研究結果證實了HM對甲狀腺未分化癌放療的增敏作用，HM放療聯(lián)合組HIF-1α蛋白以及mRNA的表達以及相關信號通路和下游因子等表達均呈現(xiàn)下降的趨勢，且明顯低于單獨放療組；同時，本研究過表達HIF-1α后的結果證實了HM對甲狀腺未分化癌放療的增敏作用，進一步提示HM可能主要通過抑制PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路等來進一步抑制HIF-1α的表達，從而抑制下游的GLUT、VEGF蛋白水平，最終提高對放療的增敏作用。但本研究僅局限于人類甲狀腺未分化癌細胞株的腫瘤模型，并非自然狀態(tài)的人類未分化癌。本研究結果可能存在一定的局限性，如選取的樣本量較少，研究尚且處于細胞試驗，期待后續(xù)研究擴大樣本量等繼續(xù)進一步進行深入的研究，提高研究結果的準確性。

綜上所述，在放療過程中，與HM聯(lián)用能夠對放療起到增敏作用，提高對甲狀腺未分化癌細胞的毒性。