陳虹，解洪強(qiáng)，趙麗娟，劉曉丹，劉敏，傅海龍，劉燕，邱松，高選（山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院，濟(jì)南250021）

胚胎植入前遺傳學(xué)檢測（preimplantation genetic testing，PGT）是在胚胎移植之前通過對(duì)配子或胚胎進(jìn)行遺傳學(xué)分析，從而選擇植入未見異常的胚胎，以提高著床率和活產(chǎn)率［1］。PGT包括非整倍體植入前基因檢測（preimplantation genetic testing for aneuploidy，PGT-A）和植入前結(jié)構(gòu)重排基因檢測（preimplantation genetic testing for structural rearrangement，PGT-SR），其中PGT-SR是針對(duì)染色體異常的夫婦在植入胚胎前檢測易位染色體的不平衡胚胎和非整倍體胚胎，以降低流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)［2］。

環(huán)狀染色體（ring chromosome）是一種環(huán)狀DNA分子，在真核生物中發(fā)生頻率較低，大約為1∶50 000［3］。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀染色體在胚胎發(fā)生過程中常會(huì)導(dǎo)致各種表型，主要是伴隨著缺失和重復(fù)引起［4］。Mantzouratou等［5］用熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）檢測1例環(huán)狀22號(hào)染色體攜帶者的胚胎，在12枚胚胎的卵裂球中僅有1枚被診斷為未見異常胚胎，但此胚胎未發(fā)育到囊胚期。FISH只能檢測有限數(shù)量的染色體［6］且活檢時(shí)期在卵裂階段，其空間分辨率受雜交失敗或信號(hào)重疊、散射等因素影響［7-9］，諸多因素會(huì)影響其結(jié)果準(zhǔn)確性。二代測序技術(shù)（next generation se-quencing，NGS）逐漸應(yīng)用于臨床，其不僅能夠同時(shí)分析所有染色體，還能夠檢測染色體非整倍體異常，具有檢測效率高、通量高、分辨率高、檢測成本低等優(yōu)勢。

為獲得胚胎植入前遺傳學(xué)篩查技術(shù)在環(huán)狀染色體患者助孕中的臨床診斷價(jià)值，本研究回顧性分析1例環(huán)狀染色體攜帶者，為臨床環(huán)狀染色體的遺傳咨詢提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 患者女，30歲，2012年結(jié)婚，性生活正常，未采取避孕措施，5年未孕。2016年期間采用指導(dǎo)同房和體外授精助孕，均未孕。2017年10月于我院行供精人工授精（artificial insemination with donor semen，AID）未孕后檢測夫妻雙方染色體并要求行PGT助孕。本研究方案已通過山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號(hào)：［2020］倫審字（3）號(hào)，患者簽署了知情同意書。

1.2 主要儀器與試劑 1640培養(yǎng)基、秋水仙素（杭州浩仁醫(yī)藥公司）；Gsl-120自動(dòng)掃描儀（德國Leica公司）；全基因組擴(kuò)增試劑盒、Veriseq DNA Library文庫構(gòu)建試劑盒、Miseq Reagent Kit測序試劑盒、Miseq測序平臺(tái)（美國Illumina公司）。

1.3 外周血染色體核型分析 無菌條件下采集患者4 mL外周血，用1640培養(yǎng)基37℃恒溫培養(yǎng)68～72 h；用1 mL注射器垂直加入60μL 40μg/mL秋水仙素，繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h后進(jìn)行細(xì)胞收獲；常規(guī)G顯帶后在Gsl-120自動(dòng)掃描儀掃描分析，計(jì)數(shù)20個(gè)中期分裂相，分析5個(gè)。

1.4 胚胎植入前遺傳學(xué)檢測

1.4.1 囊胚活檢 患者在第1周期采用長效促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（gonadropin releasing hormone agonist，GnRH-a）方案，第2周期使用拮抗劑方案進(jìn)行卵巢刺激，卵母細(xì)胞均采用胞質(zhì)內(nèi)單精子注射授精，胚胎采用玻璃化冷凍保存。對(duì)培養(yǎng)到囊胚期的胚胎，在滋養(yǎng)外胚層活檢3～5個(gè)細(xì)胞，活檢后將細(xì)胞立即放入2.5μL 1×PBS的PCR管中，如不能立即檢測則-20℃凍存［10］。

1.4.2 遺傳學(xué)檢測 活檢后的細(xì)胞使用Sureplex方法進(jìn)行全基因組擴(kuò)增。全基因組擴(kuò)增后的DNA經(jīng)酶切打斷后形成小的DNA片段，加入文庫構(gòu)建試劑盒內(nèi)的T4聚合酶將DNA片段末端補(bǔ)平，增加一個(gè)腺嘌呤脫氧核苷酸。隨后T4 DNA連接酶通過TA連接法將測序通用引物與末端補(bǔ)平后的DNA連接，完成文庫構(gòu)建。構(gòu)建好的文庫分子與測序芯片表面的共價(jià)結(jié)合的引物互補(bǔ)配對(duì)，固定到芯片表面，通過橋式PCR擴(kuò)增形成DNA序列片段，基于可逆末端終止法和邊合成邊測序的化學(xué)原理，讀取DNA片段的序列數(shù)據(jù)，最終使用BlueFuse Multi進(jìn)行數(shù)據(jù)分析來獲得樣本染色體拷貝數(shù)的評(píng)價(jià)結(jié)果。

1.5 胚胎移植 胚胎發(fā)育至囊胚期，根據(jù)卵裂球大小、規(guī)則性、胞質(zhì)折光性和碎片多寡等形態(tài)學(xué)指標(biāo)評(píng)估胚胎的質(zhì)量，結(jié)合NGS檢測結(jié)果，選擇1個(gè)形態(tài)學(xué)較好且染色體整倍性的胚胎植入母體子宮，其余符合凍存條件的胚胎冷凍保存。

2 結(jié)果

2.1 夫妻雙方外周血核型結(jié)果 女方外周血核型結(jié)果為：46，XX，r（22）（p11.2q13）；男方核型結(jié)果為：45，XY，der（13；14）（q10；q10）。見圖1。

圖1 染色體核型結(jié)果

2.2 胚胎檢測結(jié)果 經(jīng)NGS檢測后，患者第1周期1枚胚胎為非整倍體胚胎，第2周期有2枚胚胎為非整倍體胚胎，2枚胚胎為整倍體胚胎。非整倍體胚胎檢測結(jié)果均為21號(hào)染色體單體。見圖2。

圖2 胚胎檢測結(jié)果

2.3 胚胎移植、產(chǎn)前診斷及妊娠結(jié)局 患者選擇第2周期的1枚整倍體胚胎進(jìn)行植入，植入后獲臨床妊娠，隨訪其產(chǎn)前診斷結(jié)果為46，XN，r（22）（p11.2q13），見圖3。最終獲活產(chǎn)女嬰，表型正常。

圖3 產(chǎn)前診斷羊水核型結(jié)果

3 討論

本文通過對(duì)1例22號(hào)環(huán)狀染色體攜帶者家系進(jìn)行回顧性研究，使用NGS排除了非整倍體胚胎以后，移植整倍體胚胎后獲得了健康女嬰。這是首次用NGS在胚胎植入前對(duì)環(huán)狀染色體的家系進(jìn)行篩查，也是首次通過PGT篩查后獲得未見異常胚胎且活產(chǎn)的報(bào)道。

本研究中，共檢測了5枚胚胎，其中有3枚胚胎為非整倍體，異常率為60%，且非整倍體結(jié)果均為22號(hào)單體，說明在減數(shù)分裂的過程中，環(huán)狀染色體會(huì)發(fā)生丟失的情況。如果患者未進(jìn)行PGT檢測，至少移植3次才能獲得正常胎兒的活產(chǎn)，PGT能夠排除60%的非整倍體胚胎，這個(gè)異常率要明顯低于之前報(bào)道的12個(gè)卵裂球中僅有1個(gè)正常的概率［5］，出現(xiàn)這種情況的原因可能有2個(gè)：一是之前報(bào)道中使用樣本為卵裂球，本研究中使用囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞，可能在胚胎發(fā)育過程中會(huì)有一部分非整倍體被淘汰［11］；二是之前的報(bào)道中使用的方法為FISH，本研究中使用NGS方法進(jìn)行檢測，F(xiàn)ISH的準(zhǔn)確性在之前研究中其誤診率較高［12］。

本研究中移植的未見異常胚胎產(chǎn)前診斷結(jié)果為22號(hào)環(huán)狀染色體，并未見到22號(hào)染色體的片段缺失，可以推斷患者環(huán)狀染色體形成的模式是由22號(hào)染色體端粒連接而形成，根據(jù)之前的報(bào)道這種形成方式未造成遺傳物質(zhì)的丟失［13］。此種情況下環(huán)狀染色體的攜帶者通常為正常的，其攜帶狀態(tài)的發(fā)現(xiàn)主要是在接受檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)，如妊娠失敗或子女異常時(shí)［14-16］。本研究對(duì)象表型正常，因多年未孕進(jìn)行染色體檢測，與之前報(bào)道相符。

環(huán)狀染色體在有絲分裂過程中是不穩(wěn)定的，經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致嵌合體和生長緩慢［17］。但在本研究中，女方攜帶者及其子代羊水穿刺結(jié)果顯示均未有嵌合體的情況發(fā)生。在之前關(guān)于22號(hào)環(huán)形染色體的報(bào)道中也很少有嵌合體發(fā)生［18-19］。因此，環(huán)狀染色體在有絲分裂過程中產(chǎn)生嵌合體的原因還有待進(jìn)一步闡明。

NGS技術(shù)雖能排除非整倍體胚胎，但依然無法分辨正常胚胎和環(huán)狀染色體攜帶型的胚胎。因此，建議患者在進(jìn)行了胚胎植入前遺傳學(xué)檢測后，依然需要進(jìn)行羊水穿刺確認(rèn)。

本文患者為女性攜帶者，在之前研究中顯示男性攜帶者遺傳給子代的報(bào)道非常罕見。因此，男性攜帶者是否需要進(jìn)行胚胎植入前遺傳學(xué)篩查還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，環(huán)狀染色體攜帶者會(huì)產(chǎn)生異常胚胎，在進(jìn)行胚胎植入前遺傳學(xué)檢測后，可以排除非整倍體胚胎，獲得健康胎兒。但在獲得臨床妊娠后需進(jìn)行羊水穿刺核型檢測確認(rèn)子代核型。