李偉偉，于濤，劉聰，董麗霞，李剛，閆婭妮，殷秀榮（.秦皇島市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)科，河北秦皇島066004；.濰坊醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東濰坊6053）

隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，優(yōu)質(zhì)胚胎的利用率和臨床妊娠率已得到提升，但是有些優(yōu)質(zhì)胚胎仍未能著床。胚胎成功植入子宮內(nèi)膜主要有幾方面影響因素：胚胎因素、子宮內(nèi)膜的容受性以及胚胎和內(nèi)膜之間的同步性［1］。子宮內(nèi)膜的容受性對(duì)于胚胎的成功植入起關(guān)鍵作用。研究表明，2/3的反復(fù)植入失?。╮epeated implantation failure，RIF）患者是由于內(nèi)膜的不容受性引起的［2］。近年來(lái)，子宮內(nèi)膜的容受性成為學(xué)者的研究熱點(diǎn)。miRNA是一種非編碼RNA，結(jié)構(gòu)高度保守，長(zhǎng)約20個(gè)核苷酸，存在于多種組織和細(xì)胞，是一種轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子。研究表明，miRNA參與胚胎著床、子宮內(nèi)膜異位癥、反復(fù)種植失敗、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等過(guò)程［3-7］，影響著胚胎黏附、植入、子宮內(nèi)膜蛻膜化等多種與子宮內(nèi)膜容受性緊密相關(guān)的重要的生命活動(dòng)過(guò)程。高玲等［8］研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜中miR-155表達(dá)高于正常子宮內(nèi)膜，且miR-155的表達(dá)能夠調(diào)控子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞增殖與凋亡。明琪［9］研究表明，miR-155在正常子宮內(nèi)膜的分泌中期低表達(dá)，參與胚胎植入和內(nèi)膜的蛻膜化過(guò)程。金屬基質(zhì)蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）是一種能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白質(zhì)水解酶。MMP在多種生物過(guò)程中都發(fā)揮重要作用，包括細(xì)胞的增殖和分化、子宮內(nèi)膜的容受性、腫瘤的血管生成等［10-12］。本研究主要探討miR-155及其靶基因MMP16在RIF患者子宮內(nèi)膜的表達(dá)情況。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018年5月至2019年12月在秦皇島市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)科進(jìn)行體外受精與胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）或者卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm microinjection，ICSI）治療的不孕患者，其中由于男方因素或者輸卵管因素于我科首次進(jìn)行IVF-ET或ICSI助孕后妊娠并分娩的患者15例作為對(duì)照組，年齡23～37歲；至少進(jìn)行3次移植（新鮮或者解凍的胚胎，每次至少有一枚優(yōu)質(zhì)胚胎，移植優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)≥4）均未妊娠的患者15例作為RIF組，年齡23～37歲。所有研究對(duì)象均采用常規(guī)的長(zhǎng)方案進(jìn)行控制性超促排卵。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合不孕癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)［13］；②年齡23～37歲；③進(jìn)行3次及以上取卵周期，且每個(gè)周期有一個(gè)優(yōu)質(zhì)胚胎移植而未孕；④基礎(chǔ)內(nèi)分泌正常，且有正常月經(jīng)周期；⑤進(jìn)入周期前6個(gè)月未進(jìn)行過(guò)宮腔操作或使用激素類藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：①宮腔異常形態(tài)；②染色體異?；蚱渌z傳因素引起的反復(fù)植入失敗；③既往有影響卵巢反應(yīng)性的疾病，如早發(fā)性卵巢功能不全、卵巢早衰、多囊卵巢綜合征；④子宮內(nèi)膜異位癥患者；⑤可移植的優(yōu)質(zhì)胚胎（7細(xì)胞以上，碎片＜10%的卵裂胚，或者4BB、5BB的囊胚）≤3個(gè)；⑥有傳染性疾病；⑦輸卵管積水。本研究經(jīng)秦皇島市婦幼保健院倫理委員會(huì)討論通過(guò)（批準(zhǔn)文號(hào)為：秦倫字20180523號(hào)），所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑和儀器 Genesy40/50紫外分光光度計(jì)（美國(guó)賽默飛世爾公司）；7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。

人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株（HEC-1A）購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)GiBCO公司。miR-155模擬物（miR-155 mimics）、miR-155抑制物（miR-155 inhibitor）、無(wú)關(guān)序列（模擬物對(duì)照，抑制物對(duì)照）以及相關(guān)引物均購(gòu)于沈陽(yáng)萬(wàn)類生物公司；高純miRNA提取試劑盒購(gòu)于瑞士Roche公司；Lipofectamine2000購(gòu)于沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技公司；熒光定量PCR試劑盒購(gòu)于ThermoFisher公司；pmir-GLOVector質(zhì)粒購(gòu)于上海捷瑞生物工程公司；雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒以及MMP16抗體（ab73877）、β-actin抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗均購(gòu)自Abcam（上海）公司。

1.3 內(nèi)膜標(biāo)本的采集 所有研究對(duì)象均在進(jìn)入治療周期前一個(gè)月經(jīng)周期的第21～22天（LH峰的第7天或排卵后第6天）體內(nèi)行宮腔鏡取內(nèi)膜或者子宮內(nèi)膜刺激時(shí)留取。將內(nèi)膜一式2份，一份送病理科用于切片和免疫組化的檢查，一份保存于液氮中用于mRNA和蛋白質(zhì)印跡的檢測(cè)，并收集取內(nèi)膜日的空腹靜脈血2 mL，離心后留取上清液，保存于-20℃待用。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株（HEC-1A）接種于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)到80%融合時(shí)，加入胰蛋白酶消化，傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞采用Lipofectamine2000試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染（嚴(yán)格按照試劑盒操作規(guī)程完成），轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行各項(xiàng)檢測(cè)。在轉(zhuǎn)染miR-155的實(shí)驗(yàn)中，分為miR-155模擬物組、miR-155抑制物組以及各自對(duì)照組。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)miR-155以及MMP16 mRNA的表達(dá) 采用高純miRNA提取試劑盒提取總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA，然后以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。嚴(yán)格按照SYBR Green qPCR試劑盒進(jìn)行操作，反應(yīng)體系：SYBR Premix ExTaqII（2×）10μL，cDNA 2μL，4μmol/L上、下游引物各0.5μL，dH2O補(bǔ)足體系至20μL；反應(yīng)條件為：95℃5 min，循環(huán)1次；95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s，共循環(huán)40次。miR-155以U6為內(nèi)參，采用2△△Ct法計(jì)算miR-155的相對(duì)表達(dá)量。根據(jù)NCBI中MMP16和miR-155的序列號(hào)（Gene ID：4325和Gene ID：406947），利用Primer primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，均由上海生工生物公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 各基因的引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度

1.6 雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證miR-155對(duì)MMP16的調(diào)控作用 通過(guò)生物信息學(xué)手段，根據(jù)Targetscan、DB、starbase、tarbase來(lái)預(yù)測(cè)miR-155的潛在靶點(diǎn)，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)MMP16 mRNA的3′UTR區(qū)為miR-155的潛在靶點(diǎn)。將含有miR-155結(jié)合位點(diǎn)在內(nèi)的MMP16 3′UTR區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增片段插入到pmirGLO載體中，載體命名為pmirGLO-MMP16-wide type（MMP16-3′UTR-WT）；設(shè)計(jì)針對(duì)MMP16 3′UTR“種子區(qū)”的突變引物，插入到pmirGLO載體多克隆位點(diǎn)中，載體命名為pmirGLO-MMP16-mutant（MMP16 3′UTR-Mut）。所有關(guān)于載體和報(bào)告基因的轉(zhuǎn)染均由沈陽(yáng)萬(wàn)類生物公司完成。MMP16 3′UTR-WT、MMP16 3′UTR-Mut分別與miR-155模擬物、miR-155抑制物以及各自的對(duì)照（mimics control、inhibitor control）兩兩組合共轉(zhuǎn)染到HEC-1A細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后48 h，收集HEC-1A細(xì)胞進(jìn)行各組細(xì)胞螢火蟲(chóng)螢光素信號(hào)及海腎螢光素信號(hào)的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Western blot檢測(cè)MMP16蛋白表達(dá)水平 采用RIPA裂解緩沖液（Beyotime）按照標(biāo)準(zhǔn)操作從組織和細(xì)胞中提取總蛋白質(zhì)。采用BSA法測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)吸光度（A595nm）值從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算蛋白質(zhì)的濃度。根據(jù)蛋白質(zhì)濃度計(jì)算上樣量。本研究實(shí)驗(yàn)的樣品量為20μL，上樣量為30μg。臨用前加入樣品緩沖液：2%十二烷基硫酸鈉、100 mmol/L二硫蘇糖醇、60 mmol/L Tris（pH 6.8）、0.01%溴酚藍(lán)和10%甘油。在電極（正極）上依次疊放PVDF膜和凝膠。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將膜浸入封閉液（含5%脫脂奶粉的TBS）中緩慢振蕩后洗滌；加入兔抗人MMP16抗體（批號(hào)ab73877），4℃緩慢振蕩過(guò)夜；加HRP標(biāo)記的二抗（1∶10 000稀釋），室溫緩慢振蕩2 h后洗滌；以β-action作為內(nèi)參，采用Quantity One軟件將條帶轉(zhuǎn)化為灰度值，蛋白質(zhì)表達(dá)量=目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料的比較 比較RIF組和對(duì)照組的年齡、不孕年限、BMI、不孕因素、不孕類型、受精方式，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 RIF組和對(duì)照組一般資料的比較（±s）

表2 RIF組和對(duì)照組一般資料的比較（±s）

指標(biāo) RIF組（n=15）對(duì)照組（n=15） F（χ2）值 P值年齡（歲） 33.45±1.24 32.76±1.95 1.156 0.257不孕年限（年） 3.82±0.69 4.23±0.75 1.558 0.130 BMI（kg/m2） 23.13±2.47 23.78±1.96 0.798 0.431不孕類型［n（%）］ 原發(fā) 7（46.67） 6（40.00） 繼發(fā) 8（53.33） 9（60.00） 0.136 0.713不孕因素［n（%）］ 男方因素 4（26.67） 5（33.33） 輸卵管因素 7（46.67） 6（40.00） 男方+輸卵管因素 4（26.66） 4（26.67） 0.188 0.910受精方式［n（%）］ IVF 9（60.00） 7（46.67） ICSI 6（40.00） 8（53.33） 0.536 0.464

2.2 RIF組和對(duì)照組控制性促排卵及移植日內(nèi)膜厚度的情況 比較RIF組和對(duì)照組HCG日的E2、P以及獲卵數(shù)、Gn用量、Gn天數(shù)、移植日內(nèi)膜厚度，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 兩組患者控制性促排卵情況的比較（±s）

表3 兩組患者控制性促排卵情況的比較（±s）

分組 HCG日E2（pmol/L）HCG日P（nmol/L）獲卵數(shù)（個(gè)） Gn用量（IU） Gn天數(shù)（d）移植日內(nèi)膜厚度（mm）RIF組（n=15） 10 798.54±453.79 2.53±0.98 12.45±2.01 2 109.84±389.05 12.45±1.08 11.12±1.90對(duì)照組（n=15） 10 953.74±892.53 2.41±1.05 11.78±1.96 1 980.37±562.86 13.67±2.14 11.85±2.13 t值 0.600 0.324 0.924 0.733 1.971 0.991 P值 0.553 0.749 0.363 0.470 0.058 0.330

2.3 RIF患者內(nèi)膜組織miR-155的表達(dá)水平 RIF組子宮內(nèi)膜miR-155的表達(dá)水平（1.28±0.08）高于對(duì)照組（0.33±0.03），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 MiR-155調(diào)控MMP16的表達(dá) 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，miR-155模擬物和MMP16 3′UTR-WT共轉(zhuǎn)染HEC-1A細(xì)胞后，細(xì)胞的熒光信號(hào)與對(duì)照組比較明顯受到抑制；miR-155抑制物和MMP16 3′UTR-WT共轉(zhuǎn)染HEC-1A細(xì)胞后，細(xì)胞的熒光信號(hào)與對(duì)照組比較，明顯增強(qiáng)。miR-155模擬物或者miR-155抑制物共轉(zhuǎn)染MMP16 3′UTR-Mut后，熒光信號(hào)與對(duì)照組比較沒(méi)有明顯變化（P＞0.05），見(jiàn)圖1。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-155模擬物能夠下調(diào)MMP16的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平；轉(zhuǎn)染miR-155抑制物能夠上調(diào)MMP16的mRNA和蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖1 MiR-155對(duì)HEC-1A細(xì)胞的MMP16基因表達(dá)的靶向抑制

圖2 轉(zhuǎn)染miR-155對(duì)HEC-1A細(xì)胞中MMP16基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

2.5 RIF組和對(duì)照組子宮內(nèi)膜MMP16 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)情況 RIF組MMP16 mRNA的表達(dá)水平（2.11±0.15）低于對(duì)照組（3.02±0.06），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步的Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RIF組MMP16蛋白的表達(dá)水平（0.43±0.07）低于對(duì)照組（0.97±0.03），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 RIF組和對(duì)照組子宮內(nèi)膜MMP16的表達(dá)情況

2.6 RIF患者子宮內(nèi)膜中miR-155和MMP16相關(guān)性分析 經(jīng)過(guò)Pearson相關(guān)性分析，RIF患者子宮內(nèi)膜miR-155和MMP16蛋白的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.976，P＜0.05）。

3 討論

胚胎成功植入是生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。子宮內(nèi)膜在胚胎植入時(shí)有一個(gè)短暫的容受性良好的窗口期，此時(shí)期在各種激素的協(xié)調(diào)控制下，內(nèi)膜經(jīng)歷一系列的周期性改變。一般在排卵后6～8 h，子宮內(nèi)膜最適應(yīng)胚胎的植入［14］，否則容易引起植入失敗。因此，準(zhǔn)確判斷窗口期及種植窗口期子宮內(nèi)膜調(diào)控的分子機(jī)制就變得越來(lái)越重要。miRNA的異常表達(dá)對(duì)反復(fù)流產(chǎn)、胚胎著床、胚胎早期發(fā)育、子宮內(nèi)膜容受性等方面均有影響。紀(jì)娜等［15］研究表明，miR-155的表達(dá)及其靶基因Bax、Bcl-2、MMP2和MMP9的表達(dá)量對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的生長(zhǎng)有著顯著的影響。Drissennek等研究了RIF患者移植窗口期子宮內(nèi)膜miRNA的差異表達(dá)譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-155和miR-152與植入失敗相關(guān)，并經(jīng)過(guò)驗(yàn)證［16］。Chen等［17］證實(shí)整合素連接激酶低表達(dá)通過(guò)失活Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)并降低MMP-3/9表達(dá)而降低了子宮內(nèi)膜的容受性。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)、雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-155通過(guò)與MMP16 3′UTR結(jié)合，從而抑制MMP16 mRNA的表達(dá)。RIF組MMP16 mRNA的表達(dá)水平低于對(duì)照組（P＜0.05），RIF患者的MMP16與miR-155的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。MMP16是一種金屬基質(zhì)蛋白，在細(xì)胞的增殖、分泌及內(nèi)膜的容受性等方面均發(fā)揮重要作用，miR-155對(duì)子宮內(nèi)膜容受性的調(diào)節(jié)作用可能是通過(guò)下調(diào)MMP16的表達(dá)而發(fā)揮作用。在臨床工作中，我們可以通過(guò)miR-155和MMP16在內(nèi)膜上的表達(dá)情況預(yù)測(cè)反復(fù)種植失敗的情況，從而節(jié)省胚胎、減輕患者心理負(fù)擔(dān)。本課題主要研究miR-155在RIF患者內(nèi)膜的表達(dá)，在分子機(jī)制的層面研究子宮內(nèi)膜容受性的調(diào)控，以尋求改善容受性的策略，提高輔助生殖技術(shù)（ART）的成功率和胚胎利用率。而IVF-ET或者ICSI周期的患者除進(jìn)行控制性促排卵外，移植后需要進(jìn)行黃體支持，我們的研究結(jié)果只能表明RIF患者的基礎(chǔ)狀態(tài)下的內(nèi)膜miR-155和MMP16表達(dá)情況與反復(fù)植入失敗的關(guān)系。盡管與控制性促排卵周期相比，自然周期中的子宮內(nèi)膜發(fā)育可能涉及不同的基因表達(dá)模式，但子宮內(nèi)膜生物標(biāo)志物的測(cè)定可能有助于預(yù)測(cè)較低的受孕機(jī)會(huì)，為患者咨詢、子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備和凍融胚胎移植提供基礎(chǔ)。

本研究初步發(fā)現(xiàn)miR-155與RIF相關(guān)，而miR-155調(diào)控RIF的可能機(jī)制是通過(guò)調(diào)節(jié)MMP16基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)。下一步的研究需要更深入地采用功能性的實(shí)驗(yàn)來(lái)確定miR-155如何調(diào)控子宮內(nèi)膜的容受性。由于我們的樣本量不足，研究可能存在一定的偏倚。但是仍然希望這項(xiàng)研究能夠?qū)o助助孕周期中發(fā)生RIF的風(fēng)險(xiǎn)做出預(yù)測(cè)，并為臨床治療提供更為科學(xué)的指導(dǎo)。