侯建華，馬玉珍，孫文芳，陳紅，任宇（內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，呼和浩特010051）

據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，育齡期夫婦中不孕不育比率約為10%～15%，男性因素占30%～50%［1］，其中由染色體所致的遺傳因素約占男性因素的30%［2-3］，是男性不育癥的重要因素之一。Y染色體微缺失已經(jīng)成為繼克氏綜合征后的又一大男性不育的遺傳學(xué)因素［4］，受到越來越多的關(guān)注、重視和深入研究。輔助生殖技術(shù)作為治療不育癥的重要手段之一，已日益成熟并廣泛應(yīng)用。但該技術(shù)在成功幫助不育夫婦實(shí)現(xiàn)生育后代的同時(shí)，也在很大程度上將某些遺傳性不育的基因垂直傳遞給了后代，所以在決定采用輔助生殖助孕技術(shù)之前，對(duì)不育患者進(jìn)行染色體等遺傳學(xué)檢測(cè)非常必要。1976年Tiepolo等［5］首次發(fā)現(xiàn)無精子癥與Y染色體長臂上的微缺失有關(guān)，推測(cè)與Y染色體長臂1區(qū)1帶（Yq11）的精子生成基因或無精子因子（azoospermia factor，AZF）基因家族相關(guān)［6-7］。Dohle等［8］對(duì)原發(fā)性無精子癥和少精子癥患者分析發(fā)現(xiàn)，存在Y染色體AZF的微缺失，提示AZF微缺失可能是造成男性原發(fā)性不育的重要遺傳因素之一，AZF基因片段的丟失可能造成生精障礙。研究證實(shí)［9-10］，Y染色體長臂（Yq）AZF a、b和c區(qū)域中的一個(gè)或多個(gè)部位出現(xiàn)缺失時(shí)，將會(huì)造成精子發(fā)生障礙，進(jìn)而導(dǎo)致少精子癥甚至無精子癥的發(fā)生，從而影響男性生育能力。本研究探討不育男性Y染色體微缺失與輔助生殖助孕結(jié)局的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2018年5月至2020年12月在內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心就診的進(jìn)行染色體檢查及Y染色體微缺失檢測(cè)的346例少精子或無精子的男性不育癥患者，分為3組：A組為無精子癥組（105例），年齡（33.5±3.9）歲；B組為重度少精子癥組（75例），年齡（34.1±4.1）歲；C組為輕、中度少精子癥組（166例），年齡（34.2±4.3）歲。3組間年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。排除女方子宮內(nèi)膜及卵子因素（子宮內(nèi)膜異位癥、卵巢囊腫、多囊卵巢綜合征等），僅納入男方精子因素及女方輸卵管因素的94例患者進(jìn)行體外受精（IVF）/卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（ICSI）助孕治療。

1.2 主要儀器與試劑 外周血DNA柱式小量提取試劑盒購自江蘇康為世紀(jì)生物科技公司，Y染色體微缺失檢測(cè)試劑盒購自上海透景生命科技公司。根據(jù)歐洲男科協(xié)會(huì)（European Academy of Andrology，EAA）、歐洲分子遺傳實(shí)驗(yàn)質(zhì)控網(wǎng)（European Mo-lecular Genetics Quality Network，EMQN）2013版推薦標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行Y染色體微缺失檢測(cè)。該試劑盒采用2管多重PCR擴(kuò)增、4個(gè)通道［（羧基熒光素（FAM）/綠 色 熒 光蛋白（VIC）/羧基-X-羅丹明（ROX）/花菁素（Cy5）］熒光檢測(cè)的方法，判斷AZF a、b、c區(qū)域6個(gè)序列標(biāo)簽位點(diǎn)（sequence tag site，STS）的微缺失，同時(shí)設(shè)置2個(gè)內(nèi)對(duì)照基因：男性性別決定基因（sex-determining region of the Y chromosome，SRY）和編碼鋅指蛋白基因ZFX（zinc finger protein，X-linked）/ZFY（zinc finger protein，Ylinked），對(duì)標(biāo)本采集、抽提、PCR整個(gè)過程進(jìn)行質(zhì)控。

1.3 方法

1.3.1 精液常規(guī)檢查 根據(jù)《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》（第5版）的標(biāo)準(zhǔn)［11］，用SSA-Ⅱ精子自動(dòng)檢測(cè)分析系統(tǒng)（穗加軟件公司）檢測(cè)。按WHO規(guī)定，至少2次常規(guī)檢查無精子，離心沉淀后仍未見精子的診斷為無精子癥。精子濃度＜5×106/mL為重度少精子癥；5×106/mL≤精子濃度＜10×106/mL為中度少精子癥；10×106/mL≤精子濃度＜15×106/mL為輕度少精子癥。

1.3.2 Y染色體微缺失檢測(cè) 采用外周血DNA柱式小量提取試劑盒提取外周血DNA，采用Y染色體微缺失檢測(cè)試劑盒及熒光PCR儀進(jìn)行Y染色體微缺失的檢測(cè)。

1.3.2.1 DNA提取 按照外周血DNA柱式小量提取試劑盒的使用說明書提取外周血DNA。取200μL外周血加入蛋白酶K及裂解緩沖液進(jìn)行蛋白質(zhì)裂解，再加入無水乙醇離心漂洗沉淀提取DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2 PCR擴(kuò)增 采用25μL反應(yīng)體系，包括22.5μL a組或b組PCR預(yù)混液，2.5μL核酸樣本或陰性對(duì)照或質(zhì)控品。PCR反應(yīng)條件：第1階段為50℃2 min，1個(gè)循環(huán)；第2階段為95℃5 min，1個(gè)循環(huán)；第3階段為95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s，38個(gè)循環(huán)；第4階段為72℃5 min，1個(gè)循環(huán)。信號(hào)收集：在第3階段60℃時(shí)收集FAM/VIC/ROX/Cy5信號(hào)，并保存相關(guān)文件。

1.3.2.3 結(jié)果判讀 見表1。

表1 Y染色體微缺失檢測(cè)結(jié)果判讀說明

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。結(jié)果以率（%）表示，組間率的比較采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組別Y染色體微缺失結(jié)果的比較 346例男性不育癥患者中共檢出AZF微缺失17例，總?cè)笔蕿?.91%（17/346）。在105例無精子癥組（A組）中有9例微缺失，其中5例為AZF c區(qū)缺失，2例為AZF b區(qū)缺失，1例為AZF b+c區(qū)缺失，1例為AZF a+b+c區(qū)全部缺失，其中2例2～3個(gè)AZF區(qū)域同時(shí)缺失的患者又進(jìn)行再次抽血復(fù)查，結(jié)果與原結(jié)果一致；75例重度少精子癥組（B組）中有6例微缺失，均為AZF c區(qū)缺失；166例輕、中度少精子癥組（C組）中有2例微缺失，均為AZF c區(qū)缺失，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，A組的缺失率（8.57%，9/105）、B組的缺失率（8.00%，6/75）高于C組的缺失率（1.26%，2/166），χ2分別為5.466、7.171，P均＜0.05；但A組與B組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2為0.242，P＞0.05）。

表2 不同組別Y染色體微缺失種類分布及缺失率的比較

2.2 有無Y染色體微缺失患者IVF/ICSI助孕結(jié)局比較 17例Y染色體微缺失患者中有4例無精子癥患者為生精功能障礙型，通過睪丸/附睪穿刺均未找到精子，4例通過精漿果糖及生殖激素等輔助檢測(cè)判斷為非梗阻性無精子癥，以上8例均未行助孕治療，其余9例Y染色體微缺失患者均進(jìn)行了IVF/ICSI助孕治療。本研究入組的94例進(jìn)行助孕的夫婦，不孕原因女方排除排卵障礙、卵巢功能早衰、子宮內(nèi)膜因素等，只有輸卵管因素，其余均為男方嚴(yán)重少精子或無精子癥因素。有Y染色體微缺失患者與無Y染色體微缺失患者IVF/ICSI妊娠結(jié)局比較見表3，兩組妊娠率及活產(chǎn)率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

3 討論

本研究選取由EAA及EMQN推薦的AZF a（sY84、sY86）、b（sY127、sY134）及c（sY254、sY255）3個(gè)區(qū)域6個(gè)位點(diǎn)的基因缺失進(jìn)行分析，研究其與嚴(yán)重少精子癥及無精子癥的關(guān)系，這也是目前對(duì)于男性不育癥診斷和治療的共識(shí)［12-13］。結(jié)果顯示，346例進(jìn)行Y染色體微缺失檢測(cè)的患者中共計(jì)17例存在Y染色體微缺失，總?cè)笔蕿?.91%。按照精子質(zhì)量的嚴(yán)重程度分成無精子癥（A）組、重度少精子癥（B）組及輕、中度少精子癥（C）組，其Y染色體微缺失率分別為8.57%、8.00%和1.26%，A組和B組的Y染色體微缺失率均高于C組（P均＜0.05），但A組與B組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。國內(nèi)許多生殖中心也有關(guān)于無精子癥、少精子癥相關(guān)Y染色體微缺失發(fā)生的報(bào)道，但結(jié)果變異較大［14-16］。

隨著輔助生殖技術(shù)的蓬勃發(fā)展，IVF/ICSI技術(shù)用于治療男性不育已廣為接受。Y染色體微缺失是否會(huì)影響IVF/ICSI的治療結(jié)局，目前國內(nèi)報(bào)道不多且結(jié)果不一、尚存爭議。本研究346例中的94例進(jìn)行了IVF/ICSI助孕治療，結(jié)果顯示Y染色體微缺失組與無缺失組相比，臨床妊娠率及活產(chǎn)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。研究顯示［17-18］，Y染色體微缺失可能與流產(chǎn)有關(guān)，尤其是AZF c區(qū)缺失。但由于本研究Y染色體微缺失組樣本量小，比較結(jié)果可能存在偏差，還有待擴(kuò)大樣本量做進(jìn)一步的研究。因Y染色體微缺失患者未行植入前遺傳學(xué)診斷（PGD）技術(shù)進(jìn)行性別篩選，也就存在將微缺失垂直傳遞給子代男嬰以及將來男嬰成人后依舊面臨Y染色體微缺失乃至不育的風(fēng)險(xiǎn)。該結(jié)論與國內(nèi)外大部分文獻(xiàn)報(bào)道相一致［19-20］。

Y染色體微缺失能夠引起生精功能障礙造成少、弱精子癥甚至無精子癥，繼而造成男性不育癥的發(fā)生，但同時(shí)這種缺失不會(huì)傳遞給子代。而隨著ICSI技術(shù)的產(chǎn)生、發(fā)展，由Y染色體微缺失引起的少精子癥及無精子癥均可以通過ICSI技術(shù)獲得自己的子代，若獲得的子代為男嬰，這種微缺失就會(huì)垂直傳遞給子代，甚至有研究顯示這種微缺失在男性子代成長過程中會(huì)擴(kuò)大缺失片段，造成子代男性延續(xù)不育現(xiàn)象。為了避免此類情況的發(fā)生，就需要對(duì)該類微缺失患者進(jìn)行PGD技術(shù)，俗稱“三代試管嬰兒”，它能夠在胚胎植入母體前對(duì)胚胎進(jìn)行篩選，選擇沒有Y染色體的胚胎，這樣得到的女性后代就可以成功阻斷微缺失的繼續(xù)遺傳。對(duì)于男方有Y染色體微缺失欲行ICSI助孕的夫婦，需告知若為男性后代成年后同樣面臨生育問題，但不影響健康［21］。經(jīng)過充分的遺傳咨詢，絕大部分夫婦仍然選擇行常規(guī)ICSI，理論上生育男性后代的概率為50%，少部分夫婦選擇PGD挑選女性胚胎移植或供精人工授精。但對(duì)這類患者是否需要行PGD一直以來備受爭議，因?yàn)镻GD技術(shù)不僅費(fèi)用昂貴，且有可能無法篩選出合適的胚胎，這樣的結(jié)果往往讓患者難以接受。這也是目前國內(nèi)外對(duì)于PGD這項(xiàng)技術(shù)爭論的焦點(diǎn)之一。