劉玉海

（甘肅省隴西縣畜牧技術(shù)服務(wù)中心 碧巖鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，甘肅 隴西 748107）

巴貝斯蟲?。˙abesiosis），舊稱焦蟲病，是由巴貝斯屬的原蟲寄生于宿主動(dòng)物紅細(xì)胞內(nèi)引起的一類蜱傳性血液寄生蟲病，感染該病的動(dòng)物常表現(xiàn)出的臨床癥狀有高熱、貧血、黃疸、血紅蛋白尿，嚴(yán)重時(shí)引起死亡。病理剖檢具有臨床癥狀的動(dòng)物，可觀察到患病動(dòng)物的肺部、腦部、腎臟等實(shí)質(zhì)器官毛細(xì)血管中的紅細(xì)胞呈線狀或集落狀凝集，因此該病可影響這些實(shí)質(zhì)性器官的正常功能。在世界范圍內(nèi)，引起牛巴貝斯蟲病的主要病原有牛巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲、分歧巴貝斯蟲、大巴貝斯蟲、雅氏巴貝斯蟲、卵形巴貝斯蟲、隱藏巴貝斯蟲和東方巴貝斯蟲等8種[1]，其中在我國分離并流行的牛巴貝斯蟲有5種，分別是牛巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲、卵形巴貝斯蟲、大巴貝斯蟲和巴貝斯蟲未定種[2]。

牛巴貝斯蟲病給畜牧業(yè)帶來了嚴(yán)重危害，其中牛巴貝斯蟲和雙芽巴貝斯蟲分布最廣，發(fā)病率和死亡率最高，危害最為嚴(yán)重，這兩者是牛巴貝斯蟲病急性爆發(fā)的主要病原，且共享同一種傳播媒介—牛蜱屬的蜱。同時(shí)，這兩種巴貝斯蟲經(jīng)常使動(dòng)物處于混合感染狀態(tài)，患病動(dòng)物表現(xiàn)出嚴(yán)重的臨床癥狀。鑒于此病的危害，國內(nèi)外一些研究學(xué)者建立了相應(yīng)的檢測(cè)方法，如分子生物學(xué)方法、血清學(xué)方法。

分子生物學(xué)方法包括針對(duì)不同靶基因建立的常規(guī)PCR方法、恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)LAMP等，但該方法只適合急性感染狀態(tài)的?；蛟谂ｓw內(nèi)能檢測(cè)到病原。對(duì)慢性感染狀態(tài)或急性感染過后帶蟲狀態(tài)的牛在體內(nèi)檢測(cè)不到病原或蟲體的情況而言，尋找一種合適的檢測(cè)方法顯得尤為重要。血清學(xué)方法檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)的抗體，只要感染過本病，體內(nèi)有抗體產(chǎn)生，該方法就適合。研究表明，體內(nèi)抗體的存在要很長時(shí)間，甚至長達(dá)一年，為此建立一種適合的血清學(xué)方法顯得尤為重要。

為了診斷該病，已有學(xué)者建立了檢測(cè)牛巴貝斯蟲病的間接免疫熒光抗體試驗(yàn)（IFAT）和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等不同的血清學(xué)方法。但在實(shí)際臨床檢測(cè)中，間接免疫熒光抗體試驗(yàn)（IFAT）敏感性低，檢測(cè)結(jié)果容易受人為因素影響，所以在大規(guī)模血清樣品的檢測(cè)時(shí)不適用。與該方法相比，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）克服了間接免疫熒光抗體試驗(yàn)（IFAT）的缺點(diǎn)，檢測(cè)的特異性和敏感性較高，檢測(cè)結(jié)果比較客觀，且適合高通量樣品的檢測(cè)[3]。

除上述分子生物學(xué)方法和血清學(xué)方法之外，病原學(xué)顯微鏡檢查也常作為一種輔助的經(jīng)典檢測(cè)方法，該方法常用在急性感染的牛或在康復(fù)后牛的血液涂片中檢測(cè)到牛巴貝斯蟲，但該方法對(duì)檢測(cè)人員的專業(yè)技術(shù)要求比較高。

縱觀檢測(cè)牛巴貝斯蟲病的幾種方法，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）更具優(yōu)勢(shì)，抗原的來源是決定該方法優(yōu)越性的關(guān)鍵。OIE通用的檢測(cè)抗原為蟲體抗原，但在牛巴貝斯蟲病ELISA檢測(cè)中，蟲體抗原為粗抗原，經(jīng)常發(fā)生種間交叉反應(yīng)，且該抗原的來源有限，純化該蟲體抗原需要感染除蜱牛，純化過程復(fù)雜且純化量少，耗費(fèi)人力、物力、財(cái)力。為了克服這一難點(diǎn)，本研究用已建立的重組牛巴貝斯蟲棒狀體相關(guān)蛋白（rhoptry-associated protein，RAP-1）作為ELISA診斷抗原，該抗原是經(jīng)大腸桿菌體外培養(yǎng)，原核表達(dá)獲得，純化過程簡單，抗原純度和濃度均較高，且易大量繁殖純化。為此用牛巴貝斯蟲重組蛋白作為診斷抗原，對(duì)隴西縣3個(gè)不同牛場(chǎng)黃牛群中牛巴貝斯蟲感染情況進(jìn)行調(diào)查，對(duì)2016—2017年采集的血樣用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）進(jìn)行牛巴貝斯蟲病的血清學(xué)調(diào)查，試驗(yàn)過程與結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 材料

牛巴貝斯蟲重組蛋白Bo-RAP-1抗原，惠存在蘭州獸醫(yī)研究所家畜寄生蟲病研究室。辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛酶標(biāo)二抗，采購于美國Sigma公司。其他所需試劑和耗材均是國產(chǎn)，購自不同的生產(chǎn)供應(yīng)商。

188份黃牛血清均采自隴西縣3個(gè)不同地區(qū)的牛場(chǎng)。采血時(shí)保定牛只，頸靜脈采集血樣，采集完成后帶回實(shí)驗(yàn)室，放置在37℃溫箱1 h，然后放置在4℃冰箱6 h，等析出淡黃色血清后，3 000 rpm離心10 min，收集上清，放置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 ELISA試驗(yàn)方法

1.2.1 包被抗原 純化的牛巴貝斯蟲病棒狀體蛋白Bo-RAP-1作為診斷抗原，按照0.2 μg/ml劑量加到包被液中（50 mm碳酸鹽緩沖液，pH9.6），輕輕混勻后用排槍加到96孔ELISA酶標(biāo)板中，每孔加樣100 μl，放置4℃條件下13～15 h。

1.2.2 封閉 甩掉酶標(biāo)板中的包被液，將酶標(biāo)板至于ELISA專用洗板機(jī)中，用含有0.05%Tween-20的PBST洗滌液洗滌3次后，在干凈吸水紙上拍干板子，用含5%脫脂乳的封閉液進(jìn)行封閉，用排槍每孔加200 μl，放置在37℃條件下封閉1 h。

1.2.3 加血清 取出酶標(biāo)板，甩掉酶標(biāo)板中的封閉液，同1.2.2的方法洗滌后，用PBST將188份血清按1∶20稀釋，同時(shí)陰陽性對(duì)照血清也按1∶20稀釋，每個(gè)樣品平行加到酶標(biāo)板的兩個(gè)豎排孔中，每孔各加100 μl，輕搖混勻，在37℃條件下放置1 h。

1.2.4 加酶標(biāo)二抗 取出酶標(biāo)板，甩干多余液體，同1.2.2的方法洗滌3次后，用PBST將辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗牛IgG抗體（Sigma，USA）按1∶10 000倍稀釋，稀釋后每孔加100 μl，輕搖混勻，在37℃條件下放置1 h。

1.2.5 顯色 取出酶標(biāo)板，甩干多余液體，同1.2.2的方法洗滌3次后，每孔加100 μl TMB底物液顯色，用遮光紙覆蓋避光，在37℃條件下放置10 min。

1.2.6 終止 取出酶標(biāo)板，移去遮光紙，在每個(gè)反應(yīng)孔中加入100 μl 2%H2SO4溶液，用來終止反應(yīng)，此時(shí)肉眼可見顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。

1.2.7 讀數(shù) 將加了終止液的酶標(biāo)板置于專用酶標(biāo)儀上，測(cè)定光吸收值（OD450nm）。

1.2.8 判定標(biāo)準(zhǔn) 樣本OD450nm值≥0.4時(shí)判為陽性；OD450nm值＜0.4時(shí)判為陰性。

2 結(jié)果

在3個(gè)不同的牛場(chǎng)中，牛巴貝斯蟲病均存在不同程度的血清學(xué)陽性狀況，陽性血清的感染率為21.4%～30.2%（見表1）。

表1 2016—2017年隴西縣牛巴貝斯蟲病血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

牛巴貝斯蟲病是一種對(duì)家畜危害十分嚴(yán)重的血液寄生蟲病，每年4—10月是該病的傳播媒介頻繁活動(dòng)時(shí)間，在這期間，牛群感染本病的風(fēng)險(xiǎn)也最高，給養(yǎng)牛業(yè)造成了極大的損失。

隴西縣屬干旱半干旱區(qū)，在牛巴貝斯蟲和泰勒蟲等血液原蟲病的防疫上目前尚未有好的方法。這一地區(qū)由于媒介蜱的存在，每年都流行牛巴貝斯蟲病，阻礙了隴西縣畜牧業(yè)的發(fā)展。因此，應(yīng)阻斷媒介蜱的傳播，制定家畜原蟲病防疫計(jì)劃，采取滅蜱等綜合預(yù)防措施，以減少畜牧業(yè)的損失。