鄭 紅 于文江 周傳靜 尹麗麗 李 珊 劉艷明

(山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院；山東省食品藥品安全檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，濟(jì)南 250101)

苯甲羥肟酸是一種十分重要的選礦藥劑，由于其分子的極性基團(tuán)中存在著兩種帶孤對(duì)電子的氧原子和氮原子，而且這兩種原子的距離相隔較近，因此很容易與Cu2+、Ni2+、Fe3+等金屬離子形成穩(wěn)定的雜環(huán)配合物[1]。但由于苯甲羥肟酸含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)及N元素，屬較難降解有機(jī)物，給人類和生態(tài)環(huán)境帶來了潛在的風(fēng)險(xiǎn)和危害[2-4]。

小麥粉是我國(guó)北方民眾最常食用的主食之一，也是許多烘焙等加工食品的主要原料來源[5-7]。近期有輿情報(bào)道小麥粉中有添加苯甲羥肟酸非食品原料的報(bào)道，添加的方式或許是通過小麥粉改良劑加入，所以建立小麥粉改良劑中苯甲羥肟酸的測(cè)定方法至關(guān)重要。小麥粉改良劑是一些天然的或化學(xué)合成的食品添加劑，根據(jù)性能及作用可分為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑類、無機(jī)鹽類、凝膠多糖類、乳化劑類、淀粉和變性淀粉類、酶制劑類、增味增色劑類、抗氧化劑類和復(fù)合添加劑類等[8-11]。綜上可得，小麥粉改良劑的種類繁多，基質(zhì)較復(fù)雜，對(duì)建立小麥粉改良劑中苯甲羥肟酸的測(cè)定方法帶來較大挑戰(zhàn)。目前報(bào)道的測(cè)定苯甲羥肟酸的方法比較少，何旭元等[12]提出了一種采用紅外光譜溴化鉀壓片法測(cè)定苯甲羥肟酸工業(yè)品純度的方法；陳遠(yuǎn)道等[13]報(bào)道了采用紫外光度法測(cè)定水溶液中的苯甲羥肟酸；余雪花[14]采用高氯酸鐵作顯色劑直接分光光度法測(cè)定水溶液中目標(biāo)化合物的含量；周春山等[15]采用反相高效液相色譜法，對(duì)氧化鉛礦浮選藥劑銅鐵靈和苯甲羥肟酸完成了分離和測(cè)定。近期市場(chǎng)監(jiān)督管理局針對(duì)輿情公布的補(bǔ)充檢驗(yàn)方法BJS202002，此方法采用液相色譜法測(cè)定，前處理需氮吹濃縮、儀器運(yùn)行時(shí)間耗時(shí)長(zhǎng)，靈敏度較低，對(duì)分離度要求較高，因只有保留時(shí)間及光譜圖定性，若有陽性樣品還需質(zhì)譜確證[16]。目前文獻(xiàn)針對(duì)苯甲羥肟酸的研究基質(zhì)大多針對(duì)工業(yè)純品或水溶液，鮮見采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法測(cè)定的報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

AB SCIEX Triple Quad6500超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(配電噴霧電離源)，色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(75 mm×2.1 mm，1.7 μm)，MS3型渦旋混合器；SB-800DTD超聲清洗儀，Sigma 3-18K型冷凍離心機(jī)，Mili-Q超純水機(jī)。

苯甲羥肟酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度98.9%)、甲醇(色譜純)、甲酸(色譜純)和醋酸銨(色譜純)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取苯甲羥肟酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度線，配制成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18 ℃避光保存。準(zhǔn)確移取苯甲羥肟酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋配制成濃度為10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，然后用甲醇∶水(1∶1)稀釋配制成濃度為5、10、20、50、100、200、500、1 000 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取不同種類小麥粉改良劑2 g(精確至0.001 g)，置于50 mL具塞離心管中，準(zhǔn)確加入10 mL甲醇，渦旋混勻1 min，超聲提取15 min，9 000 r/min離心5 min，取上層有機(jī)層500 μL，加水500 μL稀釋一倍，渦旋混勻后過0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過濾后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.2.3 儀器分析條件

1.2.3.1 液相色譜條件

色譜條件：色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(75 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水；流動(dòng)相B：甲醇；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL；柱溫：40 ℃；洗脫方式：梯度洗脫見表1。

表1 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.2.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離源負(fù)離子(ESI-)；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；噴霧電壓：5.5 kV；霧化氣溫度：600 ℃；霧化氣壓力：55 psi；輔助氣壓力：55 psi；碰撞氣壓力：8 psi；氣簾氣壓力：35 psi。苯甲羥肟酸的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 苯甲羥肟酸的質(zhì)譜數(shù)、保留時(shí)間、分子式、分子量等信息

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

苯甲羥肟酸為弱酸類化合物，易溶于水及甲醇。根據(jù)相似相溶的原理，實(shí)驗(yàn)比較了水、甲醇/水(5∶5)、甲醇三種提取劑的回收率，對(duì)于不含淀粉或變性淀粉的小麥粉改良劑三種提取劑的回收率都在85%以上，但由于大多小麥粉改良劑中含有淀粉，前兩種提取劑由于水的存在，小麥粉改良劑呈現(xiàn)黏稠狀，導(dǎo)致樣品無法分散，實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行，只有提取劑為純甲醇時(shí)，所有樣品提取液澄清，而且回收率在90%以上，故選擇甲醇為最終提取溶劑。由于超高效液相色譜中存在溶劑化效應(yīng)，當(dāng)直接將甲醇提取后的樣品溶液注入U(xiǎn)PLC-MS/MS檢測(cè)時(shí)，由于樣品溶劑(甲醇)強(qiáng)度遠(yuǎn)強(qiáng)于初始流動(dòng)相溶劑(甲醇∶0.1%甲酸水=2∶98)強(qiáng)度，匹配性差，導(dǎo)致色譜峰形分叉，當(dāng)將樣品溶液用水稀釋一倍后，峰形明顯改善，而且響應(yīng)值并未降低，見圖1。

圖1 苯甲羥肟酸以甲醇和甲醇/水為上機(jī)溶劑下的總離子流圖

2.2 液相色譜質(zhì)譜條件優(yōu)化

本研究采用蠕動(dòng)泵直接注入苯甲羥肟酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 μg/mL)優(yōu)化各參數(shù)。苯甲羥肟酸分子結(jié)構(gòu)見圖2，分子量為137，在Q1全掃描模式下失去氫生成母離子[M-H]-；然后采用Product ion 模式，通過改變碰撞能，對(duì)子離子進(jìn)行掃描，圖2為碰撞能30 eV下，苯甲羥肟酸的子離子掃描圖，可看出苯甲羥肟酸碎片信息很豐富，主要為121、92、77、65、58的碎片離子。然后將Q1 MS模式下找到的母離子[M-H]-及Product ion 模式找到的所有碎片離子導(dǎo)入MRM掃描模式的列表中，對(duì)碰撞能等參數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)所有碎片離子中92和58的豐度最高，而且在實(shí)際樣品的測(cè)定中信號(hào)穩(wěn)定且無干擾色譜峰存在，因此本實(shí)驗(yàn)最后選以上兩個(gè)碎片作為最終的監(jiān)測(cè)離子。

圖2 苯甲羥肟酸的子離子掃描譜圖(30 eV)

此外比較甲醇-水、甲醇-醋酸銨、甲醇-甲酸水三種流動(dòng)相系統(tǒng)對(duì)其峰形及響應(yīng)值考察，結(jié)果顯示三種流動(dòng)相體系下，靈敏度差異不大，但當(dāng)采用甲醇-甲酸水為流動(dòng)相時(shí)，苯甲羥肟酸峰形最佳，故選擇甲醇-甲酸水為最終流動(dòng)相體系。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法雖然具有液相優(yōu)異的分離度和質(zhì)譜較高的分辨力，但基質(zhì)效應(yīng)的存在嚴(yán)重影響了定量的準(zhǔn)確性和精密度。為了考察不同種類小麥粉改良劑的基質(zhì)效應(yīng)，本研究采用比較陰性基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)工作溶液的擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，進(jìn)而評(píng)估小麥粉改良劑的基質(zhì)效應(yīng)。以公式A=Ks/Kp計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，其中Ks為含基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率，Kp為純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率，A為兩斜率之比，當(dāng)A≈ 1時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)為0；A>1，說明有基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)，A<1 說明基質(zhì)效應(yīng)抑制。表3為濃度為5～1 000 ng/mL線性范圍內(nèi)，純?nèi)軇┘安煌幮曰|(zhì)匹配溶液校正曲線下的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、斜率及A值，發(fā)現(xiàn)4類小麥粉改良劑(無機(jī)鹽類、淀粉和變性淀粉類、酶制劑類和復(fù)合添加劑類)的A值在0.980～1.037之間，偏差在-2%～3.7%，A≈1，基質(zhì)效應(yīng)可忽略，表明本方法去除基質(zhì)效應(yīng)能力強(qiáng)，免除了每類小麥粉改良劑需配制一套基質(zhì)匹配校正曲線的繁瑣操作。

表3 不同空白基質(zhì)下苯甲羥肟酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、斜率及A值

2.4 方法的線性范圍、檢出限與定量限

將1.2.1配制的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別注入超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)，以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，權(quán)重為1/X時(shí)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明HPLC- MS/MS方法在濃度為5～1 000 ng/mL范圍內(nèi)，r2大于0.999，線性良好。

采用在空白小麥粉改良劑中添加目標(biāo)化合物的方法，確定方法的檢出限與定量限。以對(duì)應(yīng)色譜峰響應(yīng)值3倍信噪比的質(zhì)量濃度作為方法檢出限，對(duì)應(yīng)色譜峰響應(yīng)值10倍信噪比的質(zhì)量濃度作為方法定量限，見表4。

2.5 方法回收率和精密度

采用在陰性小麥粉改良劑中添加定量限、2倍定量限、10倍定量限的目標(biāo)化合物進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，驗(yàn)證方法準(zhǔn)確度和精密度。每個(gè)濃度水平平行測(cè)定6次取平均值，計(jì)算回收率和精密度。結(jié)果見表4。陰性樣品及添加水平為定量限的MRM色譜圖見圖3。

圖3 陰性小麥粉改良劑的MRM譜圖(a,b)和添加量為定量限(0.0 5 mg/kg)的小麥粉改良劑的MRM譜圖(c,d)

表4 苯甲羥肟酸在UPLC-MS/MS上的檢出限、定量限、線性范圍、加標(biāo)回收率和精密度

2.6 與標(biāo)準(zhǔn)方法比較

將本方法與BJS202002比較，見表5。發(fā)現(xiàn)此方法的檢出限不僅比標(biāo)準(zhǔn)BJS202003降低了10倍，而且省去了氮吹濃縮的時(shí)間，減少了儀器運(yùn)行的時(shí)間，大大提高了檢測(cè)效率。此外質(zhì)譜定性比紫外光譜定性更準(zhǔn)確。

表5 本方法與BJS202003比較

2.7 樣品測(cè)定

對(duì)市售的28個(gè)小麥粉改良劑的苯甲羥肟酸采用本方法進(jìn)行測(cè)定，方法適用性好、回收率高。其中有一批次有檢出，檢出值為1.59 mg/kg，其譜圖見圖4，其他均未發(fā)現(xiàn)有陽性樣品檢出。結(jié)果表明，小麥粉改良劑中確實(shí)存在苯甲羥肟酸檢出，應(yīng)當(dāng)引起相關(guān)監(jiān)管部門及生產(chǎn)企業(yè)的重視，完善相關(guān)的檢測(cè)及限量標(biāo)準(zhǔn)。

圖4 陽性小麥粉改良劑的總離子流圖

3 結(jié)論

本研究系統(tǒng)考察了不同提取劑對(duì)小麥粉改良劑中苯甲羥肟酸的提取效果，優(yōu)化了色譜條件及質(zhì)譜參數(shù)，并考察了不同種類小麥粉改良劑的基質(zhì)效應(yīng)，建立了小麥粉改良劑中苯甲羥肟酸的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。該方法與BJS202002比較，簡(jiǎn)單、省時(shí)、靈敏度高、特異性強(qiáng)。此外基質(zhì)效應(yīng)可忽略，適用于大批量及種類繁多的小麥粉改良劑中苯甲羥肟酸的測(cè)定，提高了檢驗(yàn)工作的工作效率；同時(shí)為建立相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及監(jiān)管部門風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控提供參考。