劉 清，曾福燃，蔣匯鋒，馮安生，鄒訓重，游 遨

廣東輕工職業(yè)技術學院 生態(tài)環(huán)境技術學院，廣州510300

酪氨酸酶是一種廣泛分布于人、動物、植物以及菌類的含銅氧化酶，在結構上屬于Ⅲ型金屬酶[1，2]。酪氨酸酶與生物體內色素的生成有著直接關系，其在生物體內催化成L-酪氨酸生成L-多巴，進一步將L-多巴催化成L-多巴醌，最終多巴醌自我氧化生成黑色素[3]。人體內酪氨酸酶活性偏低將間接導致多種疾病，如白癜風、白化病以及神經(jīng)退行性疾病等[4，5]。目前，用于治療白癜風和白化病的藥物大多來自中草藥提取物，例如提取自何首烏的2，3，5，4'-四羥基芪-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（THSG）、提取自補骨脂和淫羊藿的補骨脂素、類黃酮、芹黃素等，而相關的化學合成藥物報道較少[6，7]。

二苯甲酮衍生物廣泛應用于現(xiàn)代工業(yè)，是一類重要的紫外吸收劑，主要應用于自由基紫外光固化清漆體系，如UV 涂料、UV 油墨等。還可用于防曬化妝品中的抗紫外線成分，以及用于醫(yī)藥行業(yè)生產苯乙烯聚合抑制劑以及各類香料的定香劑[8，9]?，F(xiàn)選取了11 種二苯甲酮衍生物，測試其對酪氨酸酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)部分二苯甲酮衍生物表現(xiàn)出優(yōu)異的酪氨酸酶激活活性。這一發(fā)現(xiàn)為酪氨酸酶激活劑拓展了一個新的研究方向。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

2-羥基二苯甲酮、3-羥基二苯甲酮、4-羥基二苯甲酮、4-甲氧基二苯甲酮、3-甲基二苯甲酮、4-甲基二苯甲酮、4，4′-二羥基二苯甲酮、4，4′-二甲氧基二苯甲酮、4，4′-二甲氧基二苯甲酮、4，4′-二氟二苯甲酮、3-甲氧基-4，4′-二羥基二苯甲酮（均購自上海麥克林生化科技有限公司）；蘑菇酪氨酸酶（比活力為6680 U·mg-1，購自美國Sigma 公司）；L-β-（3，4-二羥基）苯丙氨酸（L-DOPA，純度99%，）、L-酪氨酸（均購自英國Alfa Aesar 公司）；其他試劑均為國產分析純；水為去離子重蒸水。

UV-2501 紫外可見分光光度計（日本島津公司）；BPZ11D 型電子天平（Sartorius）。

1.2 測試方法[5，10]

于1.5 mL 離心管中加入890 μL 磷酸緩沖溶液（pH=6.8），隨后加入20 μL 不同濃度的化合物DMSO 溶液（控制DMSO 在體系中最終濃度為2%），然后加入10 μL 溶解于磷酸緩沖溶液的酪氨酸酶（濃度為0.5 mg·mL-1），搖勻，置于25 ℃恒溫水浴10 min。向離心管內加入80 μL 的L-DOPA 溶液（濃度為2 mg·mL-1），迅速振蕩搖勻，于25℃下進行測試。觀察溶液在475 nm 波長下的吸光度值（A 值）變化，時間3 min?？鄢彌_溶液本身對試驗的影響，根據(jù)A值增長曲線求出斜率，即為酶活力值。

酶的相對活性=K/K0×100%

K 為加入化合物時反應進程的直線斜率；

K0為不加化合物反應進程的直線斜率。

2 結果與討論

2.1 11 種二苯甲酮衍生物對酪氨酸酶活性的影響

在本實驗中，選取11 種二苯甲酮衍生物，測試其對酪氨酸酶的活性影響，結果見表1。所選化合物結構見圖1。

表1 11 種二苯甲酮衍生物對酪氨酸酶活性的影響

測試結果顯示，在選取的11 種二苯甲酮衍生物中，激活效果最好的兩種分別為4-羥基二苯甲酮與3-羥基二苯甲酮。4-羥基二苯甲酮、3-羥基二苯甲酮、2-羥基二苯甲酮與4，4′-二羥基二苯甲酮這四種化合物均在較低的濃度范圍內表現(xiàn)出強烈的酪氨酸酶激活活性，隨著濃度逐漸增大，其對酪氨酸酶的激活效果逐漸降低。有趣的是，當2-羥基二苯甲酮濃度超過300 μmol·L-1后，其對酪氨酸酶的活性影響從激活轉變?yōu)橐种?。見圖2。

2.2 4-羥基二苯甲酮和3-羥基二苯甲酮對酪氨酸酶激活動力學的機制

為進一步研究這類化合物對酪氨酸酶的激活機制，選取了其中活性最好的兩種化合物4-羥基二苯甲酮和3-羥基二苯甲酮，通過測試做出Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)曲線。見圖3。

如圖3 所示，4-羥基二苯甲酮和3-羥基二苯甲酮對酪氨酸酶激活動力學曲線均為平行線，兩組測試的最大速率（Vmax）和表觀米氏常數(shù)（Kappm）均隨著測試樣品濃度增加而增大，根據(jù)Saboury AA 關于激活劑的理論[11]，表明兩種化合物對酪氨酸酶激活動力學模式均為非競爭性。

2.3 化合物結構對其激活效應的影響

這類化合物均為二苯甲酮衍生物，它們具有相同的母體結構，但是取代基的位置、數(shù)量及取代基的差異對活性有很大的影響。

①羥基分別在4-位、3-位及2-位時，對酪氨酸酶的最大激活效率由230%降低到215%及162%。

②當化合物中羥基的數(shù)量增加時，其對酪氨酸酶的激活活性降低，4-羥基二苯甲酮對酪氨酸酶的最大激活率為230%，而4，4′-二羥基二苯甲酮僅為160%，當化合物中羥基的數(shù)量增加至3 個或者以上時，其對酪氨酸酶的影響由激活轉變?yōu)橐种芠12]。

③當化合物中的羥基被氨基取代之后，其對酪氨酸酶的激活活性大幅降低，如4-氨基二苯甲酮與3-氨基二苯甲酮對酪氨酸酶的最大激活率分別僅為147%和149%。

④這類化合物中的羥基被甲氧基、甲基或氟原子取代之后，其對酪氨酸酶的激活效果大幅度降低、甚至消失。

3 小 結

本實驗選取了11 種二苯甲酮衍生物，分別研究了其對酪氨酸酶激活效果的影響，結果顯示，大部分化合物對酪氨酸酶表現(xiàn)出良好的激活效果，其中活性最好的為4-羥基二苯甲酮，其對酪氨酸酶最大激活率達到230%。除此之外，取代基的位置、數(shù)量以及取代基本身的不同對這類化合物的活性都有很大影響。在接下來的研究中，將選取活性最好的4-羥基二苯甲酮和3-羥基二苯甲酮兩種化合物進行體內活性測試。