徐家根，浦迎秋*，顧琦欣，傅辰超

1南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院，南京市口腔醫(yī)院 藥學(xué)部，南京 210008;2南京優(yōu)科制藥有限公司，南京210009

氟比洛芬酯[1]作為一種非甾體類抗炎藥，能降低神經(jīng)敏感程度及痛覺沖擊，發(fā)揮鎮(zhèn)痛效果。氟比洛芬酯的合成過程中會(huì)使用到1-溴乙基乙酸酯作為起始物料，而2-溴乙基乙酸酯是合成的副產(chǎn)物存在于氟比洛芬酯中，這兩種物質(zhì)屬于烷基鹵化物類化合物，具有鹵代烷烴類結(jié)構(gòu)，是潛在的基因毒性雜質(zhì)[2]，需要建立有效的方法測定氟比洛芬酯中上述兩種雜質(zhì)限度，以保證該藥符合質(zhì)量要求。

由于1-溴乙基乙酸酯和2-溴乙基乙酸酯兩種物質(zhì)屬于烷基鹵化物類化合物不存在紫外吸收，無法使用常規(guī)的HPLC 法進(jìn)行檢測。而氣相色譜法是利用氣體作流動(dòng)相的色層分離分析方法，氣化的試樣被載氣（流動(dòng)相）帶入色譜柱中，柱中的固定相與試樣中各組分分子作用力不同，各組分從色譜柱中流出時(shí)間不同，組分彼此分離。根據(jù)峰的高低和面積大小，可對化合物進(jìn)行限度或定量分析。適用于易揮發(fā)有機(jī)化合物的定性、定量分析。氣相色譜法中的電子俘獲檢測器（ECD）是靈敏度較高的氣相色譜檢測器[3]，其只對電負(fù)性的化合物有信號(hào)，待測物電負(fù)性越強(qiáng)，靈敏度越高，對于中性（無負(fù)電性）化合物，如烷烴、環(huán)烷烴，則無信號(hào)或信號(hào)非常小。相比氣相色譜儀常用的火焰離子化檢測器（FID），測定含有鹵族元素的有機(jī)化合物，ECD 優(yōu)勢非常明顯，所以選擇該檢測器（ECD）檢測氟比洛芬酯中1-溴乙基乙酸酯和2-溴乙基乙酸酯的限度更為準(zhǔn)確、靈敏。

1 儀器與藥品、試劑

GC-2014 氣相色譜儀，配制電子捕獲檢測器（ECD）、直接進(jìn)樣器AOC-20i（島津公司）；BPZ11D型電子天平（Sartorius）。

供試品：氟比洛芬酯（批號(hào)：20190501、20190502、20190503，南京優(yōu)科制藥有限公司）；對照品：1-溴乙基乙酸酯（純度：95.0%，加拿大TRC 公司）；2-溴乙基乙酸酯（純度：97.9%，美國Sigma 公司）。正己烷（Merck，HPLC 級(jí)）。

2 方法與結(jié)果

2.1 限度確認(rèn)及各溶液濃度設(shè)定

根據(jù)ICH M7 指導(dǎo)原則，依照短于生命周期的可接受攝入量原則，詳情見表1。采取最為嚴(yán)格的控制條件，設(shè)定雜質(zhì)可接受攝入量為1.5 μg·d-1。根據(jù)氟比洛芬酯注射液說明書可知，其日使用劑量為50mg，由此計(jì)算出1-溴乙基乙酸酯及2-溴乙基乙酸酯在供試品中限度值均為0.003%。為保證檢驗(yàn)的重現(xiàn)性與準(zhǔn)確度，選取1-溴乙基乙酸酯定量限2 倍的濃度作為對照品溶液濃度，故確定其為0.06 μg·mL-1，依據(jù)限度為0.003%，確定供試品溶液濃度為2 mg·mL-1。根據(jù)分析天平分度值要求及操作規(guī)定，本檢驗(yàn)方法設(shè)計(jì)供試品取樣量為20 mg。

表1 短于生命周期的可接受攝入量

2.2 色譜條件

采用毛細(xì)管氣相色譜法。色譜柱：Agilent（DB-1701，60 m×0.53 mm×0.25 μm）；載氣：氮?dú)?；起始溫度?0 ℃，維持3 min。以每分鐘2 ℃的速率升溫至80 ℃，維持5 min，以每分鐘5 ℃的速率升溫至100 ℃，再以每分鐘20 ℃的速率升溫至180 ℃，維持3 min；進(jìn)樣口溫度：150 ℃；檢測器溫度：300 ℃；柱流量：4.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：1 μL。

測定法：精密量取對照品溶液和供試品溶液各1 μL，分別注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。

2.3 溶液制備

對照品貯備溶液：取1-溴乙基乙酸酯與2-溴乙基乙酸酯對照品適量，精密稱定，加正己烷溶解并定量稀釋制成每1 mL 中約含1-溴乙基乙酸酯與2-溴乙基乙酸酯均為6 μg 混合儲(chǔ)備溶液。

對照品溶液：精密量取對照品貯備溶液1 mL，置100 mL 量瓶中，加入正己烷稀釋至刻度，搖勻。

供試品溶液：取本品20 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加正己烷至刻度，搖勻。

空白溶劑：正己烷。

2.4 專屬性試驗(yàn)

取空白溶劑、對照品溶液和供試品溶液各適量，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測定，通過圖1 可知，空白溶劑及其他雜質(zhì)均不干擾本品中1-溴乙基乙酸酯和2-溴乙基乙酸酯的測定，且保留時(shí)間分別為10.572 min 及15.218 min，兩峰之間分離度為30.22，兩雜質(zhì)的理論板數(shù)分別為95388 及126121。該方法專屬性良好，適合本品中兩雜質(zhì)的限度測定。

2.5 檢測限及定量限

取“2.3”項(xiàng)下對照品貯備溶液適量，分別用正己烷逐級(jí)稀釋后，量取1 μL，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，按信噪比10∶1 計(jì)算定量限，按信噪比3∶1 計(jì)算檢測限。結(jié)果1-溴乙基乙酸酯與2-溴乙基乙酸酯的定量限及檢測限分別為0.031 880、0.008 444 μg·mL-1；0.006 237、0.003 119 μg·mL-1。

2.6 線性范圍

取“2.3”項(xiàng)下對照品貯備溶液適量，用正己烷稀釋制成每1 mL 中約含1-溴乙基乙酸酯與2-溴乙基乙酸酯均為0.6 μg 的溶液，精密量取上述溶液0.4、0.8、1.0、1.2、1.5 mL，分別置10 mL 量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，搖勻，作為兩雜質(zhì)對照品系列溶液。精密量取系列溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，以濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算得兩者的回歸方程分別為Y1=2.14×103X1-6.027 0，r=0.997 1；Y2=2.80×103X+2.077 7，r=0.997 4。結(jié)果表明，1-溴乙基乙酸酯濃度在0.024 20 μg·mL-1～0.090 76 μg·mL-1范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系（r=0.997 1）；2-溴乙基乙酸酯濃度在0.009 397 μg·mL-1～0.070 47 μg·mL-1范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系（r=0.997 4），線性關(guān)系良好。

2.7 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

取“2.3”項(xiàng)下對照品溶液，精密量取1 μL，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算各溶液峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明，1-溴乙基乙酸酯對照品溶液濃度的進(jìn)樣精密度為6.8%；2-溴乙基乙酸酯對照品溶液濃度的進(jìn)樣精密度為5.9%；RSD 均小于10%。精密度能滿足測定要求。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取氟比洛芬酯約20 mg，共6 份，采用擬定的測定方法分析。結(jié)果表明，在樣品中，1-溴乙基乙酸酯及2-溴乙基乙酸酯未檢出，方法重復(fù)性良好，能滿足本品雜質(zhì)限度的測定要求。

2.9 耐用性試驗(yàn)

分別考察了不同柱溫、進(jìn)樣口溫度、流速對氟比洛芬酯中1-溴乙基乙酸酯及2-溴乙基乙酸酯限度測定的影響，見表2。由表2 可知，上述因素在一定范圍內(nèi)變化對氟比洛芬酯中兩雜質(zhì)的分離度影響不大，兩雜質(zhì)峰的分離度均能滿足本品雜質(zhì)限度測定的要求，且供試品在不同的色譜條件下兩雜質(zhì)均未檢出。

表2 耐用性試驗(yàn)結(jié)果

2.10 回收率試驗(yàn)

分別稱取氟比洛芬酯（批號(hào)：20190501）20 mg共9 份，精密稱定，分別置于10 mL 量瓶中，根據(jù)“2.8”項(xiàng)下兩雜質(zhì)未檢出的結(jié)果，因此加樣回收率試驗(yàn)需向供試品中加入對照品儲(chǔ)備液0.8、1.0、1.2 mL，用正己烷溶解稀釋并定容至刻度，搖勻，作為待測溶液，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算測得量。1-溴乙基乙酸酯與2-溴乙基乙酸酯的平均回收率及RSD 分別為976.69%、3.4%；101.3%、4%。回收率均在80%～120%。說明本方法可以用于氟比洛芬酯原藥雜質(zhì)限度的測定。

2.11 供試品測定

取3 批供試品（批號(hào)：20190501、20190502、20190503）各適量，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算氟比洛芬酯中1-溴乙基乙酸酯與2-溴乙基乙酸酯的雜質(zhì)量。結(jié)果表明，3 批供試品中兩雜質(zhì)均未檢出，限度達(dá)標(biāo)。

3 小 結(jié)

氟比洛芬酯為氟比洛芬的前體藥物，用于手術(shù)后及各種癌癥的鎮(zhèn)痛，其優(yōu)點(diǎn)在于沒有中樞抑制作用，不影響處于麻醉狀態(tài)患者的蘇醒。為保證氟比洛芬酯原藥質(zhì)量，有必要建立合理且有效的分析方法定量檢測其雜質(zhì)，使雜質(zhì)不得超過限度要求。本文采用氣相色譜法測定藥物中烷基鹵化物類基因毒性雜質(zhì)，檢測具有選擇性好、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。