承 晨，顧崢嶸

常州市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心，常州213000

代代花為蕓香科植物代代Citrus aurantium L.var.amara Engl.的干燥花蕾，又名枳殼花、酸橙花、香橙花，始載于《開(kāi)寶本草》。主產(chǎn)于江蘇、浙江等省。味苦、酸，歸肝、胃經(jīng)，具有行氣寬中、消食、化痰的功能[1-3]。代代花中含有豐富的揮發(fā)油、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等二氫黃酮類成分及N-甲基酪胺、辛弗林等生物堿類物質(zhì)，并且黃酮類成分含量高于同科其他植物[4-6]。臨床上二氫黃酮類成分如橙皮苷，由于其具有維持血管正常滲透壓、降低血管脆性、縮短出血時(shí)間以及抗炎、抗病毒、預(yù)防凍傷等作用，被廣泛應(yīng)用于心血管疾病的輔助治療。

一測(cè)多評(píng)法是利用中藥中有效成分內(nèi)在函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系，通過(guò)測(cè)定一個(gè)成分（性質(zhì)穩(wěn)定且易得到的對(duì)照品）而實(shí)現(xiàn)多個(gè)成分的同步測(cè)定。該方法能節(jié)約對(duì)照品，減少操作步驟[7-9]。代代花中柚皮苷對(duì)照品性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)格便宜且易得，而新橙皮苷、蕓香柚皮苷價(jià)格昂貴。因此，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法同時(shí)測(cè)定了代代花中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的含量，并采用一測(cè)多評(píng)的方法，根據(jù)上述4 種二氫黃酮類成分之間的函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系，以柚皮苷為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，得到了柚皮苷與蕓香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷之間的相對(duì)校正因子（f），計(jì)算出這3 種二氫黃酮類成分的量，為代代花多指標(biāo)定量測(cè)定與質(zhì)量控制提供了全新的分析模式。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

Agilent 1200 型高效液相色譜儀（Agilent 有限公司）；LC-20A 高效液相色譜儀（日本島津公司）；Waters e2695 高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世公司）；3種色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6×250 mm，5 μm），島津Inertsil ODS-SP（4.6×250 mm，5 μm），Thermo Syncronis C18（4.6×250 mm，5 μm）；XP105DR 十萬(wàn)分之一電子天平（美國(guó)Mettler 公司）。

1.2 藥品與試劑

對(duì)照品：柚皮苷（批號(hào)110722-201714，純度93.4%），橙皮苷（批號(hào)110721-201617，純度96.1%），新橙皮苷（批號(hào)111875-201703，純度99.3%）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；蕓香柚皮苷（批號(hào)B21364，純度≥98%）購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司。甲醇、乙腈為色譜純（Merck 公司）；冰醋酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為超純水。

6 批代代花購(gòu)于多個(gè)中藥市場(chǎng)，批號(hào)分別定為：150629、141201、20130313、151014、20140410、150325，均經(jīng)專家鑒定確認(rèn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.4%磷酸-乙腈（84∶16）；檢測(cè)波長(zhǎng)：283 nm；體積流量：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷對(duì)照品適量，用50%甲醇制成混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液（蕓香柚皮苷0.05921mg·mL-1、柚皮苷1.074 10 mg·mL-1、橙皮苷0.10273mg·mL-1、新橙皮苷3.02666mg·mL-1）。精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液5 mL 至50 mL量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取代代花樣品粉末，過(guò)篩（40 目）取0.1 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱重，加熱回流1 h，放冷，加入50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 系統(tǒng)適用性與專屬性試驗(yàn) 取混合對(duì)照品、供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1 可見(jiàn)，蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，且均可通過(guò)DAD 純度檢測(cè)。各組分的理論塔板數(shù)均大于120 00，方法專屬性良好。

2.4.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液5、2、1、0.5、0.2、0.1 mL 于10 mL量瓶中，用50%甲醇稀釋配制成系列濃度的混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4.3 進(jìn)樣精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液（蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷濃度分別為5.921、107.410、10.273、302.66 μg·mL-1），按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，重復(fù)測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷對(duì)照品的峰面積的RSD 分別為0.18%、0.08%、0.13%、0.09%。表明儀器精密度良好。

表1 4 種化學(xué)成分的線性關(guān)系考察結(jié)果

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：151014）分別于配制后0、8、16、24、36、48 h 測(cè)定蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的峰面積，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果4 種成分峰面積的RSD 分別為0.71%、0.50%、0.45%、0.36%。表明供試品溶液在48 h 內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次樣品（批號(hào)：151014）6 份，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以外標(biāo)法進(jìn)行計(jì)算，測(cè)得蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量（g/g）RSD 分別為1.10%、0.85%、0.81%、0.80%。表明方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的代代花（批號(hào)：151014）50 mg，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6 份；精密加入蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷濃度分別為4.934、53.70、10.27、151.3 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液25 mL 及50%甲醇25 mL，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果表明，蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的平均回收率分別為96.89%、99.91%、97.09%、98.34%；RSD 分別為1.39%、1.15%、1.07%、1.18%。表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.5 相對(duì)校正因子f 的計(jì)算

2.5.1 待測(cè)成分f 的測(cè)定 精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液（蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷濃度分別為5.921、107.410、10.273、302.66 μg·mL-1），分別進(jìn)樣1、2、4、6、8、10 μL，根據(jù)公式計(jì)算f。

fk/m=fk/fm=（Wm×Ak）/（Wk×Am）

Ak為內(nèi)標(biāo)物峰面積，Wk為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量，Am為其他組分m 峰面積，Wm為其他組分m 質(zhì)量。

以柚皮苷為內(nèi)標(biāo)物計(jì)算其它3 種成分的相對(duì)校正因子f，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5.2 不同儀器與色譜柱對(duì)f 的影響 考察了Agilent 1200、島津LC-20A、Waters e2695 型3 種高效液相色譜系統(tǒng)和Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18、島津Inertsil ODS-SP、Thermo Syncronis C183 種色譜柱。實(shí)驗(yàn)表明，各種條件下所得的RSD＜1.5%，f 在不同的高效液相色譜儀與不同品牌色譜柱間具有良好的適應(yīng)性。見(jiàn)表3。

表2 以柚皮苷為內(nèi)標(biāo)物的3 種成分的相對(duì)校正因子

表3 不同儀器與色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響

2.5.3 不同體積流量對(duì)f 的影響 考察了體積流量為0.8、1.0、1.2 mL·min-1時(shí)對(duì)f 的影響，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同體積流量對(duì)相對(duì)校正因子的影響

2.5.4 不同柱溫對(duì)f 的影響 考察了柱溫為20、30、40 ℃時(shí)對(duì)f 的影響，結(jié)果見(jiàn)表5。

2.6 待測(cè)色譜峰的定位

在“2.1”項(xiàng)確定的色譜條件下，吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣量為10 μL，測(cè)定內(nèi)標(biāo)物質(zhì)柚皮苷的相對(duì)保留值[rm/k=tR（m）/tR（k）]，根據(jù)rm/k即可正確判斷目標(biāo)峰蕓香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的峰位置。本研究測(cè)定了相對(duì)保留值在不同品牌儀器、不同色譜柱時(shí)的重現(xiàn)性，結(jié)果表明，各待測(cè)成分與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，均可通過(guò)DAD 純度檢測(cè)，且相對(duì)保留值RSD 均小于5%，可用于待測(cè)成分色譜峰的定位。見(jiàn)表6。

表5 不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響

表6 不同儀器與色譜柱測(cè)得的相對(duì)保留時(shí)間

2.7 樣品含量測(cè)定

按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)樣量為10 μL，采用外標(biāo)法對(duì)代代花中4 種化學(xué)成分進(jìn)行含量測(cè)定，同時(shí)與一測(cè)多評(píng)法計(jì)算的結(jié)果作比較，兩種方法所得結(jié)果無(wú)顯著性差異。見(jiàn)表7。

表7 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法測(cè)得有效成分量的比較（g·g-1，%）

3 討論

3.1 因?yàn)殍制ぼ諆r(jià)格低廉、性質(zhì)穩(wěn)定，故本實(shí)驗(yàn)選擇柚皮苷為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行一測(cè)多評(píng)分析。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)水、50%甲醇、70%甲醇、甲醇等溶劑的考察，發(fā)現(xiàn)使用50%的甲醇作為溶劑，樣品的提取效率高，在對(duì)照品色譜圖中，色譜峰峰形對(duì)稱，理論塔板數(shù)高，分離效果好。通過(guò)考察超聲、回流等不同提取方法以及提取時(shí)間選擇，發(fā)現(xiàn)加入50%甲醇50 mL，加熱回流1 h，效果最佳、提取充分。

3.2 在對(duì)代代花有效成分檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇上，對(duì)蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷作全波長(zhǎng)掃描，由于4 種成分均屬于二氫黃酮類，其紫外吸收峰相似，均在283 nm 左右有最大吸收，故選定該波長(zhǎng)。

3.3 本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 外標(biāo)法測(cè)定代代花中柚皮苷的含量，同時(shí)測(cè)定并且計(jì)算出蕓香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的相對(duì)校正因子f，利用f 值計(jì)算得到了其含量，實(shí)現(xiàn)了代代花的一測(cè)多評(píng)。同時(shí)，采用外標(biāo)法計(jì)算代代花中蕓香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的量，比較后發(fā)現(xiàn)外標(biāo)法計(jì)算值與f 計(jì)算值之間沒(méi)有顯著性差異。

3.4 一測(cè)多評(píng)法是利用一種相對(duì)易得、廉價(jià)的內(nèi)參物對(duì)照品，實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)成分的同時(shí)測(cè)定，最終達(dá)到控制中藥整體質(zhì)量的目的[7]。本實(shí)驗(yàn)只考察了一測(cè)多評(píng)法在同類成分間測(cè)定的可行性，其在不同類型化合物間定量測(cè)定的可行性仍需進(jìn)一步研究。

3.5 代代花資源豐富，民間用其治療胸腹?jié)M悶脹痛、胃部下垂、脫肛及婦科疾病，應(yīng)用前景十分廣闊。本研究利用一測(cè)多評(píng)法對(duì)代代花中的蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷進(jìn)行含量測(cè)定，具有較高的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性以及可靠度，從而豐富了代代花的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，為研究提供了新思路，有利于代代花的質(zhì)量控制。