葛煒煒，吳 育**，劉兆國(guó)

1 江蘇省南通市中醫(yī)院 藥劑科，南通 226001；2 南通大學(xué) 藥學(xué)院，南通226001

我國(guó)是“飲酒”大國(guó)，且因之出現(xiàn)酒精性肝損傷發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化的態(tài)勢(shì)[1]，而長(zhǎng)期過(guò)量飲酒是造成酒精性肝病的重要原因。肝臟是酒精代謝的主要器官，因而肝臟最易受到酒精性損傷。酒精性肝病包括酒精性脂肪肝和慢性炎癥，隨著疾病的進(jìn)展，最終發(fā)展成為肝纖維化直至肝硬化[2，3]，因而對(duì)酒精性肝損傷的預(yù)防和治療顯得尤為重要。臨床研究已經(jīng)表明，還原型谷胱甘肽片在乙型肝炎、藥物型肝腎損傷方面具有良好的治療效果[4]，且其發(fā)揮藥理作用的主要機(jī)制是由于其結(jié)構(gòu)中包含有還原性的巰基，具有較強(qiáng)的還原能力有關(guān)[5]，但更為深入的機(jī)制仍然不清楚。

本實(shí)驗(yàn)采用小鼠長(zhǎng)期大量酒精攝入構(gòu)建酒精性肝損傷模型，研究還原性谷胱甘肽片對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用及潛在機(jī)制，為臨床和后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物與試劑

還原型谷胱甘肽片（規(guī)格：100 mg/片，重慶藥友制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)：CM8085）；陽(yáng)性藥水飛薊賓（規(guī)格：35 mg/片，天津天士力圣特制藥有限公司，批號(hào)：950701001）。

小鼠丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20190821）、小鼠天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20190913）、小鼠堿性磷酸酶（ALP）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20190913）、總膽固醇（TC）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20190911）、甘油三酯（TG）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20190910）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-c）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20190910）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-c）測(cè)定試劑盒（批號(hào)：20190913），均購(gòu)自于南京建成生物工程研究所有限公司；小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA 試劑盒（批 號(hào)：050201）、小鼠白介素-6（IL-6）ELISA 試劑盒（批號(hào)：053452）均購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；小鼠高遷移率族蛋白B1（HMGB-1）ELISA 試劑盒（批號(hào)：L092721）購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司；Trizol 提取液（美國(guó)Thermo 公司，批號(hào)：101005）；轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司,批號(hào)：7E380H9）；Sybrgreen 試劑盒（北京全式金生物科技有限公司，批號(hào)：H2357）；羧甲基纖維素鈉等化學(xué)試劑購(gòu)自國(guó)藥化學(xué)有限公司。

1.2 儀器

BP211 電子分析天平（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)）；Multiskan 型號(hào)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo 公司）；7500 快速實(shí)時(shí)熒光定量PCR 系統(tǒng)（美國(guó)ABI 公司）。

1.3 動(dòng)物

SPF 級(jí)白色I(xiàn)CR 小鼠，體重18～20 g，均為雄性，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2017-0007。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障環(huán)境設(shè)置：12 h/12 h 晝夜光線。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 酒精性肝損傷小鼠模型的構(gòu)建和給藥

隨機(jī)將60 只雄性ICR 小鼠等分為6 組，每組為10 只，分別為空白組、模型組、水飛薊賓陽(yáng)性藥組（50 mg·kg-1）、還原型谷胱甘肽片低、中、高3 個(gè)劑量組（200、400、800 mg·kg-1）。待動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)后，除空白組外，其余5 組均灌胃給予體積分?jǐn)?shù)（v/v）為50%的乙醇溶液（10 mL·kg-1），用于構(gòu)建酒精性肝損傷動(dòng)物模型，連續(xù)灌胃6 周[6，7]；從造模當(dāng)天開(kāi)始，空白組和模型組均灌胃給予0.5%羧甲基纖維素鈉溶液；陽(yáng)性藥組灌胃給予水飛薊賓溶液；還原型谷胱甘肽片各劑量組給予對(duì)應(yīng)濃度的谷胱甘肽溶液（注：水飛薊賓和還原型谷胱甘肽片藥物，配制時(shí)，均采用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液作為溶劑）。各組灌胃體積均為10 mL·kg-1，動(dòng)物于給藥后4 h 給予酒精造模。

2.2 小鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的檢測(cè)

待造模6 周后，各組動(dòng)物處理前禁食24 h，采用天平稱(chēng)取小鼠體質(zhì)量并作記錄。動(dòng)物麻醉后，摘取動(dòng)物眼球采血；解剖動(dòng)物，取出肝臟組織，生理鹽水清洗、濾紙吸干，迅速置于天平中稱(chēng)取各組每只動(dòng)物肝臟重量并作記錄。小鼠肝組織存入冰箱備用。

2.3 小鼠血清生化因子ALT、AST、ALP 的檢測(cè)

各組小鼠摘眼球取出全血置于無(wú)菌1.5 mL 離心管中，在4 ℃冰箱中靜置12 h，1500 r·min-1離心分離小鼠血清，將小鼠血清分裝檢測(cè)。未檢測(cè)血清置于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)血清中的ALT、AST、ALP 含量。

2.4 小鼠血清脂質(zhì)相關(guān)因子TC、TG、LDL、HDL 的檢測(cè)

參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，對(duì)各組小鼠血清中TC、TG、LDL-c、HDL-c 因子進(jìn)行檢測(cè)。

2.5 PCR 檢測(cè)肝臟TNF-α、HMGB-1、IL-6 的mRNA 水平

分別稱(chēng)取各組小鼠新鮮100 mg 肝臟組織，采用Trizol 提取液提取組織中全部RNA，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，將RNA 逆轉(zhuǎn)為相應(yīng)的cDNA，按照Sybr Green 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR 檢測(cè)，得到各組樣本擴(kuò)增曲線達(dá)到閾值的循環(huán)圈數(shù)（Ct）值，計(jì)算ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參，ΔΔCt=ΔCt樣本-ΔCt空白組平均值，采用2-ΔΔCt法定量結(jié)果并計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

引物序列為：TNF-α，上游：5’-CCGACCGAATGCAGTTGGA-3’，下游：5’-ACAGAGTATCTGCGC TCCGGA-3’；HMGB-1，上游：5’-CCTCAAGGGCTGCAACGAG-3’，下游：5’-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3’；IL-6，上游：5’-ACTGAAGATCTCCCACG GCA-3，下游：5’-GGCCGCAGAATCAGCCACCA-3’；GAPDH 上游：5’-CCTGGCACCCAGTACAAT-3’，下游：5’-GCTGATCCTCTGCTGGAA-3’。

2.6 Elisa 法檢測(cè)肝臟TNF-α、HMGB-1、IL-6 炎癥因子水平

分別稱(chēng)取各組小鼠新鮮100 mg 肝臟組織，加入1 mL PBS 緩沖液，采用玻璃勻漿器勻漿后，12000 r·min-1離心分離上清液，參照TNF-α、HMGB-1、IL-6因子Elisa 試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)上述各因子含量。

2.7 肝臟病理學(xué)HE 檢測(cè)

分別稱(chēng)取各組小鼠新鮮肝臟適量，剪取小塊肝臟組織，置于10%福爾馬林溶液中固定72 h，脫水行常規(guī)石蠟包埋，切片，按照染色步驟進(jìn)行HE 染色，中性樹(shù)膠封片后，于100 倍顯微鏡下進(jìn)行拍照。采用Image-Pro Plus 對(duì)切片視野中的脂滴空泡數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)和分析。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 還原型谷胱甘肽片對(duì)小鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的影響

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物狀態(tài)良好，飲食飲水均正常。通過(guò)對(duì)各組小鼠體質(zhì)量的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠體質(zhì)量與空白組小鼠體質(zhì)量無(wú)顯著差異。對(duì)各組小鼠的肝臟指數(shù)進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相較于空白組，模型組小鼠肝臟指數(shù)明顯增加，提示長(zhǎng)期飲酒能夠引起動(dòng)物肝臟腫大；而陽(yáng)性藥組和還原型谷胱甘肽片（400、800 mg·kg-1）各劑量組動(dòng)物肝指數(shù)明顯減少，且與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)表明，還原型谷胱甘肽片能夠緩解小鼠因長(zhǎng)期飲酒導(dǎo)致的肝臟腫大癥狀。

表1 還原型谷胱甘肽片對(duì)酒精性肝損傷小鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的影響（，n=10）

表1 還原型谷胱甘肽片對(duì)酒精性肝損傷小鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)的影響（，n=10）

注：與空白組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.01。

3.2 還原型谷胱甘肽片對(duì)小鼠血清ALT、AST、ALP 的影響

通過(guò)對(duì)小鼠血清中的ALT、AST、ALP 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物造模后，模型組小鼠血清中的ALT、AST、ALP 明顯增高，且與空白組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療后，陽(yáng)性藥水飛薊賓組和還原型谷胱甘肽片（200、400、800 mg·kg-1）各劑量組血清中的ALT、AST、ALP 明顯降低，且與模型組相比，差異具有顯著性意義（P<0.01），見(jiàn)表2。實(shí)驗(yàn)表明，長(zhǎng)期飲酒能夠損傷肝組織，而還原型谷胱甘肽片對(duì)此種肝損傷具有一定的保護(hù)作用。

表2 還原型谷胱甘肽片對(duì)酒精性肝損傷小鼠血清ALT、AST、ALP 的影響（，n=10）

表2 還原型谷胱甘肽片對(duì)酒精性肝損傷小鼠血清ALT、AST、ALP 的影響（，n=10）

注：與空白組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.01。

3.3 谷胱甘肽對(duì)小鼠血清TC、TG、LDL-c、HDL-c的影響

對(duì)各組小鼠血清中脂質(zhì)相關(guān)的指標(biāo)TC、TG、LDL-c 以及HDL-c 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型組血清中TC、TG、LDL-c 含量明顯升高，而HDL-c 含量明顯降低，且與空白組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；采用陽(yáng)性藥水飛薊賓和還原型谷胱甘肽片治療后，陽(yáng)性藥物組和還原型谷胱甘肽片（200、400、800 mg·kg-1）各劑量組血清中的TC、TG、LDL-c 含量明顯降低，而HDL-c 含量明顯升高，且與模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，P<0.05），見(jiàn)表3。實(shí)驗(yàn)表明，還原型谷胱甘肽片能夠改善小鼠慢性酒精中毒后的脂質(zhì)代謝異常。

表3 還原型谷胱甘肽片對(duì)酒精性肝損傷小鼠血清TC、TG、LDL-c、HDL-c 的影響（，n=10）

表3 還原型谷胱甘肽片對(duì)酒精性肝損傷小鼠血清TC、TG、LDL-c、HDL-c 的影響（，n=10）

注：與空白組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01

3.4 谷胱甘肽對(duì)小鼠肝臟中TNF-α、HMGB-1、IL-6 基因表達(dá)的影響

對(duì)各組小鼠肝臟組織中炎癥相關(guān)的TNF-α、HMGB-1、IL-6 基因的mRNA 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型組肝臟組織中TNF-α、HMGB-1、IL-6 基因的mRNA 水平明顯升高，且與空白組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；采用陽(yáng)性藥水飛薊賓和還原型谷胱甘肽片治療后，陽(yáng)性藥組和還原型谷胱甘肽片（200、400、800 mg·kg-1）各劑量組肝臟中的TNF-α、HMGB-1、IL-6 基因的mRNA 水平明顯降低，且與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，P<0.05）。見(jiàn)表4。

表4 還原型谷胱甘肽片對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝臟TNF-α、HMGB-1、IL-6 基因的影響（，n=10）

表4 還原型谷胱甘肽片對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝臟TNF-α、HMGB-1、IL-6 基因的影響（，n=10）

注：與空白組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01。

3.5 還原型谷胱甘肽片對(duì)小鼠肝臟TNF-α、HMGB-1、IL-6 炎癥因子水平的影響

采用試劑盒對(duì)各組小鼠肝臟組織中的TNF-α、HMGB-1、IL-6 炎癥因子水平檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組肝臟組織中TNF-α、HMGB-1、IL-6 炎癥因子明顯升高，且與空白組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；采用陽(yáng)性藥水飛薊賓和還原型谷胱甘肽片治療后，陽(yáng)性藥物組和還原型谷胱甘肽片（400、800 mg·kg-1）中、高劑量組動(dòng)物肝臟中的TNF-α、HMGB-1、IL-6炎癥因子明顯降低，且與模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），見(jiàn)表5。實(shí)驗(yàn)表明，還原型谷胱甘肽片可能通過(guò)改善模型小鼠肝臟炎癥狀態(tài)，發(fā)揮保護(hù)肝臟的作用。

表5 還原型谷胱甘肽片對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝臟TNF-α、HMGB-1 以及IL-6 因子的影響（，n=10）

表5 還原型谷胱甘肽片對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝臟TNF-α、HMGB-1 以及IL-6 因子的影響（，n=10）

注：與空白組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01。

3.6 還原型谷胱甘肽片對(duì)小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)的影響

對(duì)各組小鼠肝臟組織檢查發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠動(dòng)物肝臟明顯增大，顏色偏向于暗紅，且質(zhì)地較為蓬松，表明長(zhǎng)期飲酒導(dǎo)致了肝臟脂肪含量增加，影響肝臟質(zhì)地。通過(guò)肝組織HE 染色發(fā)現(xiàn)，相較于空白組，模型組小鼠肝臟炎癥水平較高，圓形脂滴空泡明顯較多（P<0.01），表明模型組肝臟脂滴含量較多、脂肪肝的狀態(tài)較為嚴(yán)重；采用陽(yáng)性藥和還原型谷胱甘肽片治療后，動(dòng)物肝臟脂滴空泡數(shù)顯著減少，相較與模型組肝臟炎癥和脂肪肝的狀態(tài)得以緩解，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，P<0.05）。見(jiàn)圖1 和表6。

4 討論

酒精濫用和酒精依賴(lài)是當(dāng)前世界面臨的嚴(yán)重問(wèn)題，而我國(guó)是全球酒精性肝損傷疾病人群最多的國(guó)家，嚴(yán)重危害了人民群眾的健康。研究表明，酒精性肝損傷的發(fā)病因素和病變程度與基因、性別以及飲酒時(shí)間長(zhǎng)短等諸多因素有關(guān)，其發(fā)病機(jī)制也較為復(fù)雜。乙醇進(jìn)入機(jī)體后，在肝臟乙醛脫氫酶的作用下生成乙醛，此生成的乙醛能夠通過(guò)激活肝臟中的一系列氧化酶系引起脂質(zhì)過(guò)氧化而損傷肝臟細(xì)胞，使之造成肝臟脂質(zhì)生成增加、脂滴積聚和慢性炎癥反應(yīng)[8，9]。

本研究結(jié)果表明，長(zhǎng)期酒精攝入能夠引起小鼠肝臟腫大，且伴隨著動(dòng)物血清ALT、AST、ALP 含量和脂質(zhì)代謝異常相關(guān)的TC、TG、LDL-c 顯著增加，HDL-c 明顯降低，表明酒精性肝損傷動(dòng)物模型構(gòu)建成功。對(duì)模型小鼠肝臟中炎癥因子TNF-α、HMGB-1、IL-6 表達(dá)水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，造模后動(dòng)物炎癥因子表達(dá)明顯增加，表明了酒精性肝損傷能夠?qū)е赂闻K炎癥的產(chǎn)生。

表6 還原型谷胱甘肽片對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝臟脂滴空泡數(shù)的影響（，n=10）

表6 還原型谷胱甘肽片對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝臟脂滴空泡數(shù)的影響（，n=10）

采用還原型谷胱甘肽片治療后，血清中ALT、AST、ALP 含量和脂質(zhì)代謝異常相關(guān)的TC、TG、LDL-c 顯著降低，HDL-c 顯著增加，且其肝臟中的炎癥因子和表達(dá)水平均顯著降低，表明了還原性谷胱甘肽具有保護(hù)肝細(xì)胞、減少肝臟炎癥的作用。過(guò)去的研究多聚焦于酒精能夠增加肝臟氧化應(yīng)激狀態(tài)，活性氧自由基（ROS）的大量產(chǎn)生是酒精導(dǎo)致肝臟炎癥損傷的重要機(jī)制，而忽略肝臟脂滴生成增加在肝臟損傷中的潛在作用。最新的研究表明，肝臟脂滴沉積[10]是脂肪肝的重要表現(xiàn)，嚴(yán)重影響肝臟功能，減少脂滴沉積是肝臟保護(hù)的手段和途徑，也是研究的重要課題。

本研究對(duì)肝臟病理學(xué)切片觀察發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物造模后，肝臟出現(xiàn)大量圓形脂滴孔空泡，而采用還原型谷胱甘肽片治療后，動(dòng)物肝臟中的圓形脂滴孔空泡、脂滴沉積得以緩解，表明還原型谷胱甘肽片可能通過(guò)減少脂滴沉積、發(fā)揮保護(hù)和治療酒精性肝損傷的作用。

綜上所述，本研究創(chuàng)新性的發(fā)現(xiàn)還原型谷胱甘肽片可能通過(guò)減少肝臟脂滴生成以及抑制肝臟炎癥，發(fā)揮對(duì)小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用。今后課題組將通過(guò)對(duì)肝臟中脂滴生成的相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行研究，以期更深入地揭示還原型谷胱甘肽片保護(hù)酒精性肝損傷的作用機(jī)制。