周芳妍，王曦晗，吳 芳，蔡 凡，許倍銘，陳 冰*

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院 1 藥劑科;2 老年科，上海200025

利伐沙班是一種直接作用于Xa 因子的口服抗凝藥（direct oral anticoagulant，DOAC）。2011 年經(jīng)美國(guó)FDA 批準(zhǔn)用于預(yù)防房顫、中風(fēng)以及作為深靜脈血栓和肺栓塞形成的二級(jí)預(yù)防藥物[1]。但隨著利伐沙班的廣泛使用，與其出血風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的不良反應(yīng)也明顯增加。有研究表明，使用利伐沙班非瓣膜性房顫患者大出血事件為3.6%[2]。意大利國(guó)家藥物警戒網(wǎng)絡(luò)記錄了2013～2017 年可疑不良反應(yīng)（ADR）共有與利伐沙班相關(guān)的報(bào)告1674 份[3]。鑒于利伐沙班藥動(dòng)學(xué)存在顯著個(gè)體差異[4]，認(rèn)為對(duì)其進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)（therapeutic drug monitoring，TDM）具有一定臨床價(jià)值[5]。目前國(guó)外已有文獻(xiàn)報(bào)道了利伐沙班主要采用LC-MS/MS 法測(cè)定其濃度，并對(duì)患者藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行了研究[6-7]，國(guó)內(nèi)對(duì)利伐沙班TDM 及藥動(dòng)學(xué)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)建立LC-MS/MS 法測(cè)定老年房顫患者血漿中利伐沙班的濃度，以利于進(jìn)一步探討利伐沙班在患者人群中的藥動(dòng)學(xué)與藥效學(xué)之間的關(guān)系，為臨床的個(gè)體化治療提供依據(jù)。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

API4000 型三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Applied Biosystems 公司）；BS224S 型精密天平（德國(guó)Sartorius 公司）。

1.2 藥品與試劑

利伐沙班對(duì)照品批號(hào)：14-XJZ-49-1，純度：>98%，規(guī)格：2 mg；利伐沙班-D4 內(nèi)標(biāo)批號(hào)：9-JHY-173-5，純度：>98%，規(guī)格：1 mg，均為T(mén)oronto Research Chemicals 公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈為色譜純；試驗(yàn)用水為蒸餾水。

空白血漿來(lái)源于臨床試驗(yàn)健康志愿者剩余標(biāo)本，血漿分離后于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方 法

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（3.5 μm，2.1 mm×100 mm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水（A）-甲醇（B）（采用梯度洗脫:0～0.5 min，A∶B 為90∶10；0.5～4 min，A∶B 為20∶80；4～8.5 min，A∶B 為20∶80；8.5～9 min，A∶B 為90∶10；9～10 min，A∶B 為90∶10）；流速：0.3 mL·min-1；柱溫為40 ℃。

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子化電離源（ESI），正離子方式檢測(cè)；離子噴射電壓：5500 V；離子源溫度500 ℃；GS1 壓力：275.8 kPa；GS2 壓力：275.8 kPa；掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；利伐沙班和內(nèi)標(biāo)利伐沙班-D4 的離子對(duì)分別為m/z 436.4 →m/z 145.2 和m/z 440.7→m/z 145.3；解簇電壓（DP）分別為：134.78 eV 及145.06 eV；碰撞能量（CE）分別為：36.18 eV 和40 eV。碰撞室射出電壓（CXP）電壓分別為：12.25 V 和7 V。

2.2 對(duì)照品溶液的配制

精密稱(chēng)取利伐沙班對(duì)照品2.0 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成兩份濃度均為0.2 mg·mL-1的利伐沙班儲(chǔ)備液，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線與質(zhì)控品配制。用50%甲醇-水依次稀釋利伐沙班儲(chǔ)備液，得到利伐沙班濃度分別為50、100、200、500、1000、2000、5000 ng·mL-1標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。另取對(duì)照品儲(chǔ)備液稀釋至80、400、4000 ng·mL-1的低、中、高濃度的質(zhì)控工作液。于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 內(nèi)標(biāo)溶液的配制

精密稱(chēng)取利伐沙班-D4 內(nèi)標(biāo)約1.0mg，置于10mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成濃度為0.1 mg·mL-1的利伐沙班-D4 儲(chǔ)備液。用乙腈配制成濃度為500 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液，于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品

分別取不同濃度的對(duì)照品工作液各10 μL，加入空白血漿100 μL，最終配制成系列濃度為5、10、20、50、100、200、500 ng·mL-1的利伐沙班標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品。另取不同濃度的質(zhì)控品工作液各10μL，加入空白血漿100 μL，最終配制成系列濃度為8、40、400 ng·mL-1的利伐沙班質(zhì)控血漿樣品。

2.5 血漿樣品處理

取100 μL 血漿樣品至1.5 mL 離心管中，加入10 μL 50%甲醇-水混勻，加入200 μL 含內(nèi)標(biāo)溶液（500 ng·mL-1）乙腈沉淀劑，渦旋振蕩5 min，19419×g離心10 min，吸取上清液置于進(jìn)樣管中，取5 μL 進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下檢測(cè)條件進(jìn)行LC-MS/MS 分析。

2.6 患者標(biāo)本檢測(cè)

選取我院老年科3 名服用利伐沙班片（拜瑞妥，10 mg/片，批號(hào)：BXJ7VR1，拜耳公司）房顫患者，除利伐沙班外，近期均未服用華法林、Xa 因子抑制劑、肝素類(lèi)抗凝劑等藥物。服藥劑量為20 mg qd?；颊叻庍_(dá)穩(wěn)態(tài)后，在給藥前與給藥后2 h，經(jīng)肘靜脈取血，3.0 mL 轉(zhuǎn)移至乙二胺四乙酸（EDTA）處理的抗凝管中，3000 g 離心10 min，分離的血漿于-80 ℃冰箱中保存，按“2.5”項(xiàng)血漿樣品處理后進(jìn)樣，采用建立的LC-MS/MS 法測(cè)定血漿中利伐沙班峰的血藥濃度。

3 結(jié)果

3.1 質(zhì)譜掃描

將利伐沙班和利伐沙班-D4 儲(chǔ)備液分別用50%甲醇-水稀釋成100 ng·mL-1的溶液，采用微量注射泵以10 μL·min-1的恒定速度泵入質(zhì)譜系統(tǒng)，進(jìn)行碎片離子分析，相應(yīng)的二級(jí)全掃描質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

3.2 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

分別取空白溶液、50%甲醇-水基質(zhì)、標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品（加入內(nèi)標(biāo)溶液）和患者用藥后血漿（加入內(nèi)標(biāo)溶液）樣本，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖2。

利伐沙班和內(nèi)標(biāo)利伐沙班-D4 保留時(shí)間分別為5.55 min 和5.57 min，峰形良好，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾利伐沙班及內(nèi)標(biāo)的測(cè)定。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限

取“2.4”項(xiàng)下系列標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，按“2.5”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)行分析。以待測(cè)物濃度（ng·mL-1）為橫坐標(biāo)X，以利伐沙班與利伐沙班-D4 的峰面積比值為縱坐標(biāo)Y，用加權(quán)（W=1/X）最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，得到回歸方程Y=1.11×10-2X-1.12×10-3，r=0.999 7（n=5）。表明利伐沙班在5～500 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。最低定量下限為5 ng·mL-1，連續(xù)測(cè)定5份樣本，準(zhǔn)確度為112.8%，精密度的RSD 為4.49%。

3.4 精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)

按照“2.2”項(xiàng)下方法配制利伐沙班低、中、高（8、40、400 ng·mL-1）3 個(gè)濃度的質(zhì)控血漿樣品。按“2.4”項(xiàng)下方法處理樣本，各濃度均配制5 份進(jìn)樣分析，連續(xù)測(cè)定3 天。根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)算質(zhì)控血漿樣本的濃度，計(jì)算日內(nèi)及日間精密度。見(jiàn)表1。

3.5 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

表1 血漿中利伐沙班方法精密度和準(zhǔn)確度測(cè)定結(jié)果

按照“2.2”項(xiàng)下方法，分別配制利伐沙班低、中、高（8、40、400 ng·mL-1）3 個(gè)濃度的質(zhì)控血漿樣本，按“2.4”項(xiàng)下方法操作，每個(gè)濃度平行測(cè)定5 份樣本，得峰面積A；將人空白血漿按“2.5”項(xiàng)下方法處理，經(jīng)離心后取上清液，加入適量利伐沙班對(duì)照品溶液，配制成濃度為8、40、400 ng·mL-1的質(zhì)控樣品，渦旋混合后進(jìn)樣得峰面積B，每個(gè)濃度平行測(cè)定5 份樣本；在50%甲醇-水中加入適量利伐沙班對(duì)照品溶液，配制成質(zhì)量濃度為8、40、400 ng·mL-1的質(zhì)控樣品，渦旋混合后進(jìn)樣得峰面積C，每個(gè)濃度平行測(cè)定5 份樣本。利伐沙班提取回收率（%）=A/B×100%，基質(zhì)效應(yīng)（%）=B/C×100%。計(jì)算得到提取回收率在90.8%～101.3%，基質(zhì)效在95.2%～103.3%。見(jiàn)表2。

表2 利伐沙班提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)（n=5，）

表2 利伐沙班提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)（n=5，）

同法計(jì)算內(nèi)標(biāo)利伐沙班-D4 的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)分別為92.2%～99.5%和95.8%～98.9%。

3.6 穩(wěn)定性考察

用空白血漿配制利伐沙班低、中、高（8、40、400 ng·mL-1）3 個(gè)濃度的質(zhì)控血漿樣本，每個(gè)濃度平行配制5 份。血漿樣本分別在室溫放置12 h、反復(fù)凍融3 次和-20 ℃凍存30 d，按照“2.5”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，計(jì)算濃度。結(jié)果見(jiàn)表3。這表明在上述考察條件下，利伐沙班穩(wěn)定性良好。

3.7 方法應(yīng)用

3 位老年科房顫患者服用利伐沙班后，穩(wěn)態(tài)谷濃度分別為30.0、14.1、38.5 ng·mL-1，而給藥后2 h的峰濃度分別為119、94.3、149ng·mL-1。上述結(jié)果存在一定個(gè)體差異，后續(xù)研究有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量。

表3 血漿中利伐沙班的穩(wěn)定性（n=5）

4 討論

目前大多研究采用LC-MS/MS 法，以ESI 正離子作為電離模式檢測(cè)。Baldelli S 等[8]采用一種固相萃取法，較好地排除了血漿中的干擾；但是操作步驟更為復(fù)雜，成本也較高。另一種處理方法是蛋白沉淀，操作較為簡(jiǎn)便，易于批量處理，是目前LCMS/MS 法分析生物樣本的常用處理方法。

本文試驗(yàn)了不同pH 環(huán)境下利伐沙班的峰型，最后選擇0.1%甲酸水-甲醇作為流動(dòng)相，采用梯度洗脫的方式，檢測(cè)物質(zhì)峰型良好，且避免了血漿中內(nèi)源物質(zhì)的干擾。選用乙腈作為沉淀劑進(jìn)行蛋白沉淀，且與以前建立的檢測(cè)方法相比[9]，利伐沙班標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍較寬（5～500 ng·mL-1），同時(shí)定量下限為5 ng·mL-1，低于服藥穩(wěn)態(tài)后的谷濃度，能夠滿(mǎn)足進(jìn)行TDM 與臨床藥動(dòng)學(xué)研究的快速監(jiān)測(cè)。

直接作用的口服抗凝藥雖與華法林相比具有更好的安全性，一般情況下不需要進(jìn)行常規(guī)治療藥物監(jiān)測(cè)；但由于其吸收速度快，給藥2～4 h 可達(dá)到峰值，藥動(dòng)學(xué)變異系數(shù)較大，可達(dá)到30%～40%[10]。據(jù)有關(guān)研究表明，利伐沙班在每日劑量20 mg 時(shí)，2～4 h達(dá)到峰值，其峰濃度中值為270（189～419）ng·mL-1，谷濃度中值為26（6～87）ng·mL-1，谷濃度與峰濃度之間相差8～10 倍，半衰期6～13 h[5]。在固定劑量下，利伐沙班引起的出血風(fēng)險(xiǎn)和治療效果，也提示著患者個(gè)體間差異；同時(shí)目前缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的抗凝血功能監(jiān)測(cè)和抗凝逆轉(zhuǎn)劑，增加了臨床應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)[11]。如上種種原因需在一定的情況下對(duì)DOACs 進(jìn)行監(jiān)測(cè)，例如創(chuàng)傷、緊急手術(shù)和溶栓治療窗口內(nèi)的近期卒中、懷疑藥物相互作用等。此外，對(duì)于某些特殊患者如腎功能不全和胃腸吸收不良的、特別是老年人，日常監(jiān)測(cè)也是必要的。

本研究對(duì)3 例服用利伐沙班達(dá)到穩(wěn)態(tài)患者的血藥濃度進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)谷濃度與峰濃度分別為（27.5±12.4）ng·mL-1與（120.8±27.4）ng·mL-1，與國(guó)外研究接近且存在較大個(gè)體變異?？梢灶A(yù)測(cè)對(duì)服用利伐沙班的特定患者進(jìn)行TDM 具有較大臨床意義。