周宋匯，沈培亮，汪瑞辰*

1 江蘇省腫瘤醫(yī)院，江蘇省腫瘤防治研究所，南京醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，南京 210009；2 伊爾瑞生物科技（江蘇）有限公司,南京211500

我國結(jié)腸癌的患者逐年增多，且呈現(xiàn)年輕化的態(tài)勢；結(jié)腸癌具有發(fā)病隱秘、致死率極高的特點(diǎn)[1，2]，亟待尋求特效的治療藥物。隨著腫瘤免疫療法研究的深入，從這一角度入手研發(fā)有效藥物有望成為潛在治療腫瘤的手段[3]。目前免疫檢查點(diǎn)程序性死亡受體-1（programmed death receptor-1，PD-1）/程序性死亡配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）信號通路是研究的熱點(diǎn)[4，5]。腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的PD-L1 與體內(nèi)淋巴細(xì)胞表面的PD-1 受體相結(jié)合之后，能夠誘導(dǎo)后者發(fā)生免疫功能的喪失甚至凋亡，進(jìn)而出現(xiàn)免疫逃逸[6]。研究表明，結(jié)腸癌高表達(dá)PDL1 與結(jié)腸癌不良預(yù)后密切相關(guān)[7]。近年來，臨床和基礎(chǔ)研究表明，沙利度胺對多種腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用[8]，確有潛在的抗腫瘤效應(yīng)；但是其對HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞的作用機(jī)制尚不清楚。因此本研究從腫瘤細(xì)胞免疫檢查點(diǎn)PD-L1 表達(dá)角度探討沙利度胺抗腫瘤的機(jī)制，以期為臨床和實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

1 材 料

1.1 細(xì)胞株

人結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞HT-29 細(xì)胞株，購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 藥品和試劑

沙利度胺（西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司，純度98%，批號：RCD105541）；胎牛血清（上海吉泰依科賽生物科技有限公司，批號：11H228）；CCK-8 試劑盒（日本DOJINDO 公司，批號：DV652）；RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)基（美國Gibco 公司，批號：1855639）；TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份公司，批號：20190318）；Anti-PD-L1 APC 流式抗體（Ebioscience 公司，批號：673DH93）；c-Myc、STAT3 和HIF-1 一抗（美國CST 公司）；β-Actin 一抗和兔二抗（南京Bioworld 公司）；其他試劑均為分析純。

1.3 儀器

Multiskan 型酶標(biāo)儀、3110 型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）；Accuri C6 型流式細(xì)胞分析儀（美國BD 公司）；PowerPacBasic 型電泳儀及成像系統(tǒng)（美國Bio-rad 公司）。

2 方 法

2.1 CCK-8 方法檢測沙利度胺對HT-29 腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響

采用含10%胎牛血清的RPMI-1640 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)HT-29 腫瘤細(xì)胞，處于對數(shù)生長期的HT-29 細(xì)胞經(jīng)消化和計(jì)數(shù)后以5×103個(gè)每孔接種于96孔無菌細(xì)胞培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)板置于37 ℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)12 h，使其貼壁。沙利度胺按照預(yù)先設(shè)置的濃度進(jìn)行加藥（0、10、20、40、80、160、320 μmol·L-1）繼續(xù)作用48h，每個(gè)藥物濃度設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。作用結(jié)束后，每孔分別加入10 μL CCK8 試劑，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h，培養(yǎng)計(jì)數(shù)后將細(xì)胞培養(yǎng)板于酶標(biāo)儀450 nm 波長處檢測其吸光度值（A），并計(jì)算其增殖抑制率。

增殖抑制率（%）=（A藥物孔-A空白孔）/（A對照孔-A空白孔）×100%。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測沙利度胺誘導(dǎo)HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡

取處于對數(shù)生長期的HT-29 腫瘤細(xì)胞，經(jīng)消化和計(jì)數(shù)后,以2×105個(gè)每孔接種于6 孔無菌細(xì)胞培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)板置于37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)24 h 后,加入不同濃度的沙利度胺（0、20、40、80 μmol·L-1）作用48 h，每個(gè)濃度設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。待作用完成后，采用不含EDTA 的胰酶消化液小心消化腫瘤細(xì)胞，無菌磷酸緩沖液（PBS）清洗細(xì)胞兩遍，每孔收集1×105個(gè)腫瘤細(xì)胞加入100 μL 的緩沖液重懸細(xì)胞，加入Annexin V 5 μL 混勻后，加入碘化丙啶（PI）5 μL，混勻，室溫、避光、反應(yīng)15 min 后，用流式細(xì)胞儀檢測HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞表面PD-L1 表達(dá)

取處于對數(shù)生長期的HT-29 腫瘤細(xì)胞，經(jīng)消化和計(jì)數(shù)后，以2×105個(gè)每孔接種于6 孔無菌細(xì)胞培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)板置于37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)24 h，加入不同濃度的沙利度胺（0、20、40、80 μmol·L-1）作用24 h，每個(gè)濃度設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。待作用完成后，采用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化液小心消化腫瘤細(xì)胞，無菌PBS 清洗細(xì)胞兩遍，離心、計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞，調(diào)整其濃度為5×106mL，每孔分別加入5 μL 的Anti-PD-L1 APC 流式抗體，吹打混勻，室溫避光孵育15 min，用流式細(xì)胞儀檢測HT-29 腫瘤細(xì)胞表面PD-L1 的表達(dá)。

2.4 Western Blot 法檢測c-Myc、STAT3、HIF-1蛋白的表達(dá)

取處于對數(shù)生長期的HT-29 腫瘤細(xì)胞，經(jīng)消化和計(jì)數(shù)后，以2×105個(gè)每孔接種于6 孔無菌細(xì)胞培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)板置于37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)24 h，加入不同濃度的沙利度胺（0、20、40、80 μmol·L-1）作用24 h，PBS 清洗細(xì)胞3 次，加入RIPA 細(xì)胞裂解液于冰上充分裂解腫瘤細(xì)胞，以12000g離心取上清液，加入上樣緩沖液（5×loading buffer，1∶4），100 ℃變性10 min，樣品保存于-80 ℃冰箱中待用。蛋白定量后，每孔蛋白樣品上樣25 μg，電泳條件為40 A、90 min，轉(zhuǎn)膜條件為110 V、80 min。轉(zhuǎn)膜封閉后分別加入蛋白一抗（c-Myc、STAT3、HIF-1 和β-Actin）置于4 ℃冰箱中孵育過夜，洗膜后室溫孵育兔二抗2 h，TBST 洗滌5 次，采用ECL 發(fā)光液顯影。以Image J 軟件進(jìn)行蛋白定量統(tǒng)計(jì)。

2.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用Graph Pad Prism 5 軟件作圖分析，采用SPSS19.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），采用Student-Newman-Keuls post hoc 檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 沙利度胺對HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響

經(jīng)不同濃度的沙利度胺溶液作用于HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞48 h 后，CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沙利度胺在濃度為40、80、160、320 μmol·L-1時(shí)能夠明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29 的增殖；與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；且其IC50為85.37 μmol·L-1。結(jié)果表明，沙利度胺對HT-29 腫瘤細(xì)胞的生長具有顯著的抑制作用，還具有一定的劑量依賴性。見圖1。

3.2 沙利度胺對HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響

經(jīng)不同濃度的沙利度胺作用后，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，沙利度胺在濃度為20、40、80 μmol·L-1時(shí)能夠明顯促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡；與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果表明，沙利度胺能夠促進(jìn)HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡。見圖2。

3.3 沙利度胺對HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞PD-L1 表達(dá)的影響

經(jīng)不同濃度的沙利度胺作用后，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，沙利度胺在濃度20、40、80 μmol·L-1時(shí)能夠明顯減少HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞PD-L1 的表達(dá)；與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖3。

3.4 沙利度胺對HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞c-Myc、STAT3、HIF-1 信號的影響

對沙利度胺減少HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞PD-L1 表達(dá)的機(jī)制進(jìn)行探討，鑒于c-Myc、STAT3 和HIF-1信號能夠促進(jìn)HT-29 腫瘤細(xì)胞PD-L1 的表達(dá)。通過Western Blot 檢測發(fā)現(xiàn)，沙利度胺在濃度為20、40、80 μmol·L-1時(shí)，能夠明顯減少HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞中c-Myc、STAT3 和HIF-1 蛋白的表達(dá)含量；與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。表明沙利度胺可能通過抑制c-Myc、STAT3 和HIF-1 蛋白表達(dá)，從而減少HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞PD-L1 的表達(dá)發(fā)揮抗腫瘤的效應(yīng)。見圖4。

4 討論

結(jié)腸癌發(fā)病率逐年升高且易發(fā)生淋巴和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其預(yù)防和治療是世界性難題，探尋切實(shí)有效的治療藥物和策略是當(dāng)前的攻關(guān)重點(diǎn)。癌細(xì)胞通過多種機(jī)制促進(jìn)增殖轉(zhuǎn)移并逃避機(jī)體的免疫傷害，PD-L1 是癌細(xì)胞表面表達(dá)的重要分子，能夠與免疫細(xì)胞表面的PD-1 分子相結(jié)合、抑制免疫細(xì)胞功能，使癌細(xì)胞免于免疫細(xì)胞識別和傷害，最終實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。當(dāng)前針對PD-L1 分子已經(jīng)開發(fā)出一系列單抗藥物，成功用于臨床并取得了良好的治療效果[9]，因而探尋能夠靶向腫瘤細(xì)胞表面PD-L1 分子的藥物顯得極有意義。沙利度胺商品名“反應(yīng)停”，因其在治療妊娠反應(yīng)時(shí)所產(chǎn)生的強(qiáng)致畸性而廣為熟知。近年來，許多文獻(xiàn)指出，沙利度胺具有潛在的抗腫瘤特性，已經(jīng)應(yīng)用于多種腫瘤的治療[10]。本研究從腫瘤免疫檢查點(diǎn)角度對其機(jī)制進(jìn)行探討。實(shí)驗(yàn)顯示，沙利度胺在體外能夠明顯抑制HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，表明其體外抗結(jié)腸癌細(xì)胞的作用。進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)對癌細(xì)胞表面PD-L1 的表達(dá)進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，沙利度胺能夠減少癌細(xì)胞表面PD-L1 的表達(dá)水平，表明它是潛在的增強(qiáng)抗腫瘤免疫作用的藥物，其作用機(jī)制值得深入的研究。通過對促進(jìn)癌細(xì)胞PD-L1 分子表達(dá)的上游信號檢測發(fā)現(xiàn)，沙利度胺能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞上游c-Myc、STAT3、HIF-1 信號分子的表達(dá)[11]，表明其可能通過抑制信號分子減少癌細(xì)胞表面PD-L1 的表達(dá)而發(fā)揮抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的作用。

綜上所述，本研究從體外細(xì)胞角度實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沙利度胺具有潛在的抗結(jié)腸癌的作用，其機(jī)制可能與抑制c-Myc、STAT3、HIF-1 信號分子減少癌細(xì)胞表面PD-L1 的表達(dá)有關(guān)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)部分，將采用免疫正常和免疫缺陷小鼠模型，研究沙利度胺的抗腫瘤效應(yīng)及其作用機(jī)制。