楊佳翰，張炳輝，顧鋼，楊玄松，秦明月，謝小芳*

1 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002；

2 福建省煙草專賣局煙草科學(xué)研究所，福州 350003；

3 福建省作物設(shè)計(jì)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350003

轉(zhuǎn)錄因子是一類重要的調(diào)控蛋白，它能與特定DNA序列（順式作用元件）結(jié)合，從而激活或抑制特定基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[1]。堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子（Basic region/leucine zipper，bZIP）是真核生物中廣泛存在的一個重要基因家族[2]。bZIP轉(zhuǎn)錄因子具有一個長度約為60～80個氨基酸的保守bZIP結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由堿性區(qū)和亮氨酸拉鏈區(qū)組成[3]，其中，堿性區(qū)高度保守，長約16個氨基酸，包含一個核定位信號和一個識別并結(jié)合啟動子特定核酸序列的保守N-X7-R/K基序；亮氨酸拉鏈區(qū)的保守性較低，靠近堿基區(qū)的C端，它由多個七肽重復(fù)序列組成，每七個氨基酸的第七位含有一個亮氨酸，亮氨酸具有被其他疏水性氨基酸所取代的特性，如異亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸等。該區(qū)域通過兩個bZIP轉(zhuǎn)錄因子之間的疏水力纏結(jié)形成同源或異源二聚體疏水性氨基酸，參與bZIP蛋白與DNA結(jié)合前的二聚反應(yīng)。

迄今為止，已有許多真核生物的bZIP基因家族成員在全基因組范圍內(nèi)被成功鑒定。例如：擬南芥（75個）[4]，水稻（89個）[3]，玉米（125個）[5]，蓖麻豆（100個）[6]，蘋果（114個）[7]，甘薯（41個）[8]，番茄（69個）[9]和大豆（131個）[10]等植物。已有研究表明：bZIP轉(zhuǎn)錄因子參與種子萌發(fā)過程、幼苗的產(chǎn)生和形成、花芽分化和花器誘導(dǎo)等[11-13]。與此同時，bZIP轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與了鹽脅迫，干旱脅迫，冷脅迫等非生物脅迫響應(yīng)和生物脅迫防御等生物學(xué)過程。例如，擬南芥AtbZIP17對鹽脅迫響應(yīng)明顯，可以直接或間接地激活鹽脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)，對提高植物的耐鹽性具有重要作用[14]；在水稻中，干旱處理下OsbZIP20和OsABA45的表達(dá)都大幅上調(diào)，過表達(dá)OsbZIP71可顯著提高水稻的抗旱性[15-16]；在低溫脅迫中，Liu等[17]在水稻中鑒定出8 個與苗期低溫抗性相關(guān)的bZIP 基因（OsbZIP08、OsbZIP35、OsbZIP38、OsbZIP46、OsbZIP63、OsbZIP72、OsbZIP73和OsbZIP76）；此外，小麥TabZIP1[18]，辣椒CabZIP1等基因參與了病原菌侵染的防御響應(yīng)[19-20]。在煙草中，Kusano等鑒定了一個受低溫誘導(dǎo)的bZIP基因（tbz17）[21]，Yang等[22]研究發(fā)現(xiàn)tbz17及其家族成員tbzF與煙葉的衰老緊密相關(guān)，這兩個基因在衰老的煙葉中大量表達(dá)，其轉(zhuǎn)錄本主要位于衰老葉片中的保衛(wèi)細(xì)胞和微管組織中。另外，Kuhlmann等[23]發(fā)現(xiàn)煙草bZIP 轉(zhuǎn)錄因子BZI-1在煙草的病原防御響應(yīng)和生長素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用。

煙草是我國的重要經(jīng)濟(jì)作物之一。煙草收獲的主要器官是煙葉，因此葉片的生長發(fā)育、葉色轉(zhuǎn)換等非常重要。煙葉的成熟衰老常常被當(dāng)作一種逆境，其實(shí)質(zhì)是各類細(xì)胞的程序性死亡，從而適應(yīng)外界環(huán)境改變帶來的生存脅迫，在基因調(diào)控下細(xì)胞自主選擇終結(jié)生命歷程的過程[24-25]。一些轉(zhuǎn)錄因子會激活或抑制逆境基因的表達(dá)，從而影響植物的抗逆性和生長發(fā)育[26-29]。大量研究證明：bZIPs家族廣泛參與植物的生長發(fā)育、果實(shí)成熟和顏色轉(zhuǎn)化、植物正常衰老過程和逆境脅迫響應(yīng)[23,30]，因此，在煙草中系統(tǒng)研究bZIP轉(zhuǎn)錄因子對研究煙葉的生長發(fā)育成熟具有重要意義。本研究擬通過生物信息學(xué)方法在全基因組范圍內(nèi)對煙草bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族成員進(jìn)行系統(tǒng)分析，結(jié)合不同成熟度煙葉的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，探究該家族成員在不同成熟度煙葉中的表達(dá)情況，研究結(jié)果將為相關(guān)bZIP轉(zhuǎn)錄因子的功能研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 煙草bZIP基因家族成員的鑒定和理化性質(zhì)預(yù)測

從擬南芥公共資源TAIR（http://www.arabidopsis.org/）中下載擬南芥75個bZIP基因的蛋白質(zhì)序列[4]，以擬南芥bZIP的蛋白質(zhì)序列作為母序列，利用blast程序在茄科植物基因組數(shù)據(jù)庫（https://solgenomics.net/）搜索煙草的bZIP候選蛋白序列，將相似度≥30%，并且E值≤-10的序列確定為最初的候選蛋白。進(jìn)一步利用NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的CDD程序分析煙草bZIP候選蛋白序列的結(jié)構(gòu)域。將包含bZIP轉(zhuǎn)錄家族特有保守結(jié)構(gòu)域的序列確定為最終的候選蛋白，利用ExPASy軟件（https://www.expasy.org）對煙草bZIP候選蛋白相關(guān)的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測分析，將對應(yīng)的基因號，基因的染色體定位信息和蛋白質(zhì)信息構(gòu)建列表。

1.2 煙草bZIP基因進(jìn)化分析

運(yùn)用Clustal X軟件[31]對最終確認(rèn)的候選bZIP蛋白序列進(jìn)行多序列比對，運(yùn)用軟件MEGA-X[32]構(gòu)建煙草bZIP蛋白家族的進(jìn)化樹，使用的算法為鄰接法（Neighbor-joining model；NJ），Bootstrap值設(shè)定為1000。

1.3 煙草bZIP基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)域分析

利用Edwards等人發(fā)布的普通煙草K326的基因組數(shù)據(jù)庫（2017）（https://solgenomics.net/organism/Nicotiana_tabacum/genome），下載煙草bZIP基因結(jié)構(gòu)的相關(guān)信息文件（包括GFF 文件、核酸序列文件以及蛋白序列文件），利用在線的軟件工具Gene

Structure Display Server（GSDS）（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）[33]分析煙草bZIP基因外顯子/內(nèi)含子（intron/exon）的分布情況并繪制基因結(jié)構(gòu)圖。利用軟件DNAman 6.0（Lynnon Biosoft，Quebec，Canada）對煙草bZIP家族成員的bZIP保守域氨基酸組成進(jìn)行可視化分析，默認(rèn)參數(shù)。進(jìn)一步通過MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）[34]在 線工具分析煙草bZIP蛋白的保守基序（motif），設(shè)置參數(shù)為：20個motif，最小和最大長度分別設(shè)定為5和200 bp。

1.4 不同成熟度煙葉bZIP基因的表達(dá)分析

以福建三明尤溪大田生長的普通煙草品種翠碧一號的中部葉（從下往上數(shù)8～10葉位）為材料，在同一田塊且種植間隔7天的兩批植株中選擇長勢相對均勻一致的煙株，由三位熟悉煙葉成熟度判定的專業(yè)人員根據(jù)葉色，葉脈和絨毛等外觀特征[35]共同衡量后，在同一時間段分別采收5個成熟度（M1、M2、M3、M4和M5）的葉樣。每3個葉片為一個樣品，3個生物學(xué)重復(fù)。采用打孔器沿著葉片主脈均勻打孔取樣，迅速置于-80℃液氮保存?zhèn)溆谩２捎冒偬┛酥参锟俁NA提取試劑盒（離心柱型）分別提取各檔成熟度煙葉樣品總RNA。采用Illumina HiSeqTM 2000平臺開展煙葉樣品轉(zhuǎn)錄組測序分析，其中，文庫構(gòu)建和測序工作由百邁克生物科技有限公司完成，利用基因的FPKM值衡量基因表達(dá)水平[36]。從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得煙草bZIP家族各成員的FPKM值（log2轉(zhuǎn)換），利用R語言gplots包的heatmap功能[37]繪制不同成熟度煙葉的bZIP基因表達(dá)熱圖。采用SYBR Premix Ex Taq（Takara）兩步法進(jìn)行qRT-PCR測定，分析煙草部分bZIP基因成員在不同成熟度煙葉中的表達(dá)情況，qRT-PCR擴(kuò)增引物序列和煙草Actin內(nèi)參基因引物見表1。每個樣品3次技術(shù)重復(fù)和3次生物學(xué)重復(fù)。相對表達(dá)水平衡量采用2-△△Ct方法[38]，以M1成熟度的基因表達(dá)量為參照，計(jì)算bZIP基因家族成員在不同成熟度煙葉中的相對表達(dá)量，根據(jù) 3次生物學(xué)重復(fù)結(jié)果計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。

表1 煙草NtbZIP基因qRT-PCR分析特異引物Tab. 1 NtbZIP gene-specific primers of tobacco used for qRT-PCR analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草bZIP基因家族成員理化性質(zhì)及其染色體定位

通過相似性搜索和結(jié)構(gòu)域判定，在煙草中共鑒定出126個bZIP基因，依次重新編號命名為NtbZIP1～NtbZIP126，基因的具體信息列于表2，包括基因的ID，物理位置，外顯子數(shù)目，蛋白長度、分子量和等電點(diǎn)等。由表2可知：煙草NtbZIP基因的外顯子數(shù)目、蛋白長度和分子量等差異較大。其中，NtbZIPs外顯子數(shù)目最小的僅為1，最大達(dá)到13個，含有1個和4個外顯子的基因數(shù)量最多，分別達(dá)到26和33個；編碼蛋白質(zhì)長度最大達(dá)812 aa（NtbZIP22），最小僅為112 aa（NtbZIP117）；相對分子質(zhì)量最小為12913.63 Da（NtbZIP117），最 大 的 為87319.33（NtbZIP22）；理 論 等 電 點(diǎn)在5.03（NtbZIP123）～9.79（NtbZIP6）之間。染色體定位結(jié)果顯示，126 個NtbZIP基因中有58個NtbZIP定位于染色體中，且基因在各染色體上的分布不均勻，其中第19號和第24號染色體最多，各含7個NtbZIP基因，而第8、14、18和20號染色體上未發(fā)現(xiàn)NtbZIP基因。另外的68個NtbZIP基因定位到Scafford上，目前尚無法確定這些基因在染色體上的具體位置。

表2 煙草bZIP基因家族成員信息Tab. 2 The characters of bZIP gene family members of Nicotiana tabacum

表2（續(xù)1）

表2（續(xù)2）

表2（續(xù)3）

2.2 煙草bZIP基因的結(jié)構(gòu)與進(jìn)化

利用126個NtbZIPs基因的蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖1a）：煙草的bZIP基因家族可分為11個亞族（bootstrap≥80%），分別為A、B、C、D、E、F、G、H、I、J和S亞族，其中，由于bootstrap值太低，NtbZIP123未能歸到任何一個亞族。在11個亞族中，S是最大的亞族，包含28個成員。與此同時，D、A、I和G的成員也較多，分別含有23，20，17和11個成員，這5個亞族成員的總和為NtbZIP家族成員總數(shù)的78.6%。此外，B亞族的成員最少，僅有2個，亞族J和H也僅含有3個成員?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明（圖1b）：NtbZIP基因序列的長度、內(nèi)含子/外顯子的數(shù)量和分布差異較大。綜合結(jié)構(gòu)和進(jìn)化分析結(jié)果（圖1）可以發(fā)現(xiàn)：在同一亞族中的大多數(shù)成員具有相似的基因結(jié)構(gòu)。例如：在最大的S亞族成員中，大多數(shù)基因的長度較短，在28個成員中有23個僅含有1個外顯子，占該亞族總數(shù)的82.1%；而在D亞族中，NtbZIP家族成員的基因長度較大，外顯子數(shù)目較多（7-12個）。由此可以推測：該家族基因的結(jié)構(gòu)與進(jìn)化關(guān)系密切，家族成員的擴(kuò)張與內(nèi)含子的插入或缺失有關(guān)。

2.3 煙草bZIP蛋白保守結(jié)構(gòu)

為分析煙草bZIP家族成員蛋白的結(jié)構(gòu)域組成，進(jìn)一步利用DNAman軟件對126個NtbZIP蛋白中的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行多序列比對分析，并將其可視化（圖2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：煙草bZIP結(jié)構(gòu)域非常保守，在其N端都含有一個堿性區(qū)域（N-X7-R/K），隨后具有保守的RK或KK以及亮氨酸拉鏈區(qū)域，該結(jié)構(gòu)參與形成bZIP蛋白與 DNA 結(jié)合之前的二聚體化過程，此外，發(fā)現(xiàn)部分亮氨酸被其他疏水殘基（異亮氨酸、纈氨酸核甲硫氨酸等）取代的現(xiàn)象，該結(jié)果與前人的研究一致[4, 39]。

圖2 煙草bZIP家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域序列比對Fig.2 Alignment of conserved domain of the bZIP family proteins in Nicotiana tabacum

利用在線工具M(jìn)EME分析NtbZIPs基因的蛋白序列中Motif組成的多樣性，結(jié)果表明（圖3）：在126條煙草的bZIP蛋白序列中共鑒定出20個Motif（表3），同一亞族的成員大多含有相同的基序組成和排列順序。例如：D亞族成員都含有Motif1、Motif6、Motif2、Motif5、Motif15和Motif3；E亞族和I亞族，大多數(shù)成員含有Motif1和Motif4，該結(jié)果與基因結(jié)構(gòu)的分析情況（圖1）一致。與此同時，不同亞族中的蛋白序列Motif組成和分布存在較大差異，有些Motif只出現(xiàn)在特定的亞族中，例如Motif2、Motif3和Motif5只出現(xiàn)在D亞族中，Motif13和Motif7只出現(xiàn)在F亞族中，Motif12和Motif17只存在于A亞族，Motif9只存在于I亞族；而一些基序是幾個亞家族共有的，例如：Motif4存在于E和I亞族，Motif18存在于A、G和I亞族等。由這些結(jié)果可以推測：NtbZIPs基因在進(jìn)化過程中出現(xiàn)了功能分化。

圖1 煙草bZIP家族基因結(jié)構(gòu)與進(jìn)化Fig. 1 Gene structure and evolution of bZIP family in Nicotiana tabacum

表3 煙草bZIP蛋白的20個預(yù)測保守基序Tab. 3 Sequences of 20 predicted motifs of NtbZIP proteins

進(jìn)一步利用CDD對20個基序進(jìn)行鑒定，其中，Motif1注釋為bZIP結(jié)構(gòu)域組成部分，在126條NtbZIPs蛋白中，除NtbZIP38和NtbZIP124外，其余124條蛋白序列均含有Motif1。此外，Motif2注釋為DOG1結(jié)構(gòu)域組成部分，該結(jié)構(gòu)域與種子的休眠有關(guān)[40-41]。Motif16被注釋為MFMR結(jié)構(gòu)域，Motif10被注釋為bZIP_C結(jié)構(gòu)域的組成部分。

2.4 煙草bZIP基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了探究煙草bZIP轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)化歷程，整合126條煙草的bZIP蛋白序列和75條擬南芥的bZIP蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并對照J(rèn)akoby 等在擬南芥的分組規(guī)則分類[4]，將bZIP蛋白共聚成11個分支（圖4），每個分支中都含有煙草和擬南芥的bZIP成員，而且每個亞族基因數(shù)量分布比例相似，說明這兩個物種的bZIP 轉(zhuǎn)錄因子家族成員并未因物種差異而單獨(dú)聚類。在這11個分支中，S分支是含有成員最多的亞族，共有43個的成員，其中煙草28個，擬南芥15個，而H包括的bZIP成員最少（5個），其中煙草2個，擬南芥3個。與擬南芥相比[4]，本研究新增加的一個亞族J，該亞族共有6個成員，包括煙草3個成員和擬南芥3個成員。除J亞族外，擬南芥bZIP的聚類與前人研究結(jié)果基本一致，只有少數(shù)成員在聚類中分到不同的分支，說明bZIP基因家族在進(jìn)化上相對保守。在整個系統(tǒng)發(fā)育樹中共發(fā)現(xiàn) 77對同源姐妹對，其中4對為直系同源蛋白，73對為旁系同源蛋白（煙草53 對，擬南芥20對），由此可見，煙草的旁系同源蛋白數(shù)目是擬南芥的兩倍多，該結(jié)果可能是由于普通煙草源于絨毛煙草和林煙草的染色體加倍進(jìn)化而來，因此存在大量的相似序列。

圖 3 bZIP蛋白質(zhì)保守基序組成與分布Fig. 3 Conserved motifs for bZIP proteins in Nicotiana tabacum

圖4 煙草與擬南芥bZIP基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig. 4 Phylogenetic analysis of Nicotiana tabacum and Arabidopsis thaliana bZIP genes

2.5 不同成熟度煙葉中NtbZIP基因的表達(dá)情況

為分析NtbZIPs在不同成熟度煙葉中的表達(dá)變化，本研究采集了5個成熟度（M1-M5）煙葉。從5檔成熟度煙葉的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲取NtbZIPs基因的表達(dá)值，剔除部分未表達(dá)或低表達(dá)的基因（PFKM＜0.5），進(jìn)一步繪制NtbZIPs基因（77個）的表達(dá)熱圖。由圖5可知：不同NtbZIP基因的表達(dá)量差異較大，其中，分支Ⅲ中的27個NtbZIP基因在5個成熟期表達(dá)量較低，而分支Ⅱ的10個NtbZIP基因表達(dá)量較高，包 括NtbZIP82，NtbZIP27，NtbZIP111，NtbZIP76，

NtbZIP32，NtbZIP120，NtbZIP115，NtbZIP119，NtbZIP123和NtbZIP31等基因。值得注意的是：NtbZIP84，NtbZIP120，NtbZIP119和NtbZIP115等基因的表達(dá)量隨著成熟度的提高呈現(xiàn)規(guī)律性下降趨勢。這些結(jié)果暗示了煙草NtbZIP家族成員間在功能上可能具有多樣性。

進(jìn)一步挑選表達(dá)變化比較明顯的NtbZIP27，NtbZIP84，NtbZIP115和NtbZIP119等4個 基 因 開展RT-PCR驗(yàn)證，由結(jié)果可知（圖6）：NtbZIP27基因在M1-M4等4個成熟期的表達(dá)變化不大，在M5成熟期表達(dá)量下降近5倍。與M1成熟期相比，NtbZIP84，NtbZIP115和NtbZIP119等基因的表達(dá)隨著成熟度的提高呈現(xiàn)明顯下降趨勢，這3個基因在M1和M5成熟期的表達(dá)量差異近10倍。此外，隨著煙葉成熟度提高，這4個NtbZIP基因的表達(dá)在qRTPCR分析（圖6）和轉(zhuǎn)錄組測序分析（圖5）中表現(xiàn)出類似的變化趨勢，說明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果較可靠。

圖5 NtbZIPs基因在不同成熟度煙葉中的表達(dá)情況Fig. 5 The expression of NtbZIPs in tobacco leaves at different stage of maturity

圖6 NtbZIPs基因在不同成熟度煙葉中的表達(dá)情況Fig. 6 Relative expression level of 4 NtbZIPs in tobacco leaves at different stage of maturity

3 討論

在全基因組測序完成的前提下，全基因組范圍內(nèi)的基因鑒定為基因功能研究提供了一條便捷有效的途徑。bZIP轉(zhuǎn)錄因子是真核生物中普遍存在的一個大基因家族，許多物種在全基因組水平上開展了bZIP基因家族的鑒定。本研究對煙草中bZIP基因家族的成員進(jìn)行了全基因組水平上鑒定和分析，最終獲得了126個NtbZIP基因。由于煙草基因組主要通過基因富集區(qū)測序獲得，且其全基因組測序尚未完成，可能存在未被鑒定的NtbZIP基因。因此，煙草中實(shí)際存在的bZIP將超過本研究鑒定的126個。顯然，煙草中bZIP基因數(shù)量高于擬南芥（75個）[4]，水稻（89個）[3]，甘薯（41個）[8]和番茄（69個）[9]等物種中的bZIP基因數(shù)量，該結(jié)果主要源于普通煙草是異源四倍體，其存在兩套異源基因組，分別來自于S基因組供體林煙草和T 基因組供體絨毛煙草兩個祖先種，大約在 20 萬年前經(jīng)過一次種間雜交產(chǎn)生[42]。因此，在本研究鑒定的126個bZIP基因中存在大量的旁系同源基因（53對）。研究表明，基因倍增后，最初的結(jié)果是出現(xiàn)兩個完全相同的基因，在選擇壓作用下，其中一個基因保持原有的功能，而另一個基因更容易產(chǎn)生突變積累，從而變成假基因或產(chǎn)生新的功能[43]。因此，多倍化可能是產(chǎn)生新基因的主要途徑，這可能是導(dǎo)致煙草中bZIP基因擴(kuò)張的重要原因。

基因的表達(dá)模式是基因功能的重要體現(xiàn)。已有的研究表明，bZIPs家族廣泛參與植物的生長發(fā)育、顏色轉(zhuǎn)化和植株的正常衰老過程[30]。本研究中不同成熟期煙葉NtbZIPs基因的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)：NtbZIPs基因在不同成熟度中廣泛表達(dá)，而且大多NtbZIPs基因在煙葉的不同成熟期表現(xiàn)出差異性表達(dá)，其中NtbZIP84，NtbZIP115，NtbZIP119和NtbZIP120等基因表達(dá)量較高，且隨成熟度提高表現(xiàn)出規(guī)律性變化下降趨勢，暗示這些基因隨著煙葉成熟度的提高，物質(zhì)轉(zhuǎn)化和降解的完成，表達(dá)量逐漸下降。與此同時，部分基因隨著成熟度提高表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢（NtbZIP123），前人研究中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，例如Yang等[22]研究發(fā)現(xiàn)：煙草bZIP家族成員tbzF和tbz17基因的表達(dá)量與煙葉中的葉綠素含量呈負(fù)相關(guān)。此外，在不同成熟度NtbZIP基因表達(dá)的分析發(fā)現(xiàn)（圖5）：分支Ⅱ的10個NtbZIP基因表達(dá)量很高，值得注意的是：這10個基因中，除了NtbZIP82，NtbZIP27和NtbZIP123外，其余7個均分布在S亞族中（圖1），暗示該亞族中的這些基因可能在不同成熟度中煙葉中發(fā)揮重要作用，并且可能具有類似的功能，但具體生物學(xué)功能還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

通常認(rèn)為，聚類中關(guān)系越密切則其相似性就越大，因此，聚在同一亞族中的基因在結(jié)構(gòu)與功能上往往有一定的相似性。已有研究表明：擬南芥中的AT2G35530基因主要通過調(diào)控光、GA及 ABA等基因的應(yīng)答[44]；擬南芥中的 AT5G06950與AT5G06960為bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族的 TGA 亞族，參與擬南芥的抗逆調(diào)控[45-46]。因此，我們推測在系統(tǒng)樹G亞族中（圖4）與擬南芥AT2G35530聚類距離較近的NtbZIP96，NtbZIP97，NtbZIP98和NtbZIP99等基因可能參與調(diào)控光、GA與ABA激素的代謝；D亞族中與擬南芥AT5G06950和AT5G06960聚類距離較近的NtbZIP45，NtbZIP46，NtbZIP49和NtbZIP50等基因可能在逆境響應(yīng)中發(fā)揮作用，具體有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本文所提供的NtbZIPs基因的表達(dá)和進(jìn)化信息，可為NtbZIPs基因的進(jìn)一步功能研究奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究在煙草基因組中共鑒定了126個NtbZIP基因。NtbZIP成員基因結(jié)構(gòu)多樣，蛋白質(zhì)長度差異較大，共分為11個亞族。進(jìn)化分析顯示NtbZIP基因分化的時間早于擬南芥與煙草分化的時間，異源四倍體的普通煙草中存在大量的NtbZIP旁系同源基因?qū)Γ?3對）。本研究中NtbZIPs在不同成熟度煙葉中廣泛表達(dá)，其中NtbZIP84，NtbZIP115，NtbZIP119和NtbZIP120等基因表達(dá)量隨成熟度提高而逐漸降低。系統(tǒng)分析基因家族各成員的序列特征、進(jìn)化關(guān)系和表達(dá)模式等可為基因的功能研究提供指導(dǎo)。