馬銘澤，史鳳顯，翟若南，王 航，李 珂，許春艷，牛 淑，姚 武，周 舫

鄭州大學公共衛(wèi)生學院勞動衛(wèi)生與職業(yè)病學教研室 鄭州 450001

肺癌的增殖、侵襲和轉移過程往往伴隨著上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)進程[1-2]。EMT上皮細胞在形態(tài)學上發(fā)生向間(充)質細胞表型轉變并獲得遷移能力，在胚胎生長、組織重塑、腫瘤轉移等過程中起著至關重要的作用[3-4]。EMT被認為是組織、器官等纖維化進程的主要原因，也是增強肺癌細胞侵襲其他器官和轉移能力的重要過程[5]。因此，探討肺癌細胞的EMT進程對于肺癌的防治具有重要意義。

轉化生長因子β( transforming growth factor β，TGF-β)是一種多功能細胞因子，在細胞和組織的生長、發(fā)育、分化中起關鍵作用，對細胞的增殖、分化、凋亡，細胞間質產生，胚胎發(fā)育，器官形成，免疫功能，炎癥反應，創(chuàng)傷修復等有重要的調節(jié)作用，同時可以誘導細胞EMT[6-7]。熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)是細胞在受到高溫刺激及其他環(huán)境因素如毒素、氧壓、營養(yǎng)缺乏、重金屬、強紫外線照射等刺激后，所產生的高度保守并具有防御作用的一組蛋白質[8-9],對細胞的分化、增殖等過程具有調節(jié)作用。研究[10-11]發(fā)現替普瑞酮作為HSP70誘導劑，在大鼠胃黏膜細胞中能誘導HSP70高表達并對細胞起到保護作用，并在其他器官中如心、腦、肝等組織中也有相同的作用。本研究選擇用TGF-β刺激A549細胞建立EMT細胞模型，用替普瑞酮誘導HSP70高表達，探討HSP70在TGF-β誘導的人肺腺癌A549細胞EMT進程的作用，為肺癌的防治提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1細胞與主要試劑人肺腺癌細胞A549細胞購自中國科學院。二甲基亞砜(DMSO)、RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術有限公司)，RPMI 1640培養(yǎng)基(北京索萊寶科技有限公司)，胎牛血清(美國GEMINI公司)，TGF-β(美國Peprotech公司)，替普瑞酮(美國MCE生物公司)，HSP70、E-cadherin、Vimentin蛋白一抗(按1∶1 000稀釋，美國Cell Signaling Technology公司)，GAPDH一抗、辣根過氧化物酶標記的二抗(武漢三鷹生物技術有限公司)，倒置顯微鏡(日本Nikon公司)，DYCZ-24DN電泳儀(北京六一儀器廠)，自動酶標儀(美國Bio Teck公司)。

1.2細胞培養(yǎng)采用含體積分數為10%胎牛血清和含青霉素、鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37 ℃、含體積分數5%CO2、95%濕度條件下，對A549細胞進行復蘇、傳代、培養(yǎng)，待細胞達到80%融合時，用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代，取對數生長期細胞進行后續(xù)實驗。

1.3替普瑞酮誘導A549細胞HSP70表達的最佳作用條件用0、25、50、100、200 μmol/L的替普瑞酮處理A549細胞，24 h后收集細胞提取蛋白，采用Western blot法檢測HSP70的表達，同時利用細胞增殖活性實驗檢測A549細胞的活性，篩選出替普瑞酮誘導HSP70高表達的最佳作用條件。

1.4實驗分組將A549細胞分為4組：對照組，只加入RPMI 1640培養(yǎng)基；TGF-β組，加入5 μg/L的TGF-β和RPMI 1640培養(yǎng)基；TGF-β+替普瑞酮組，加入5 μg/L的TGF-β、50 μmol/L的替普瑞酮和RPMI 1640培養(yǎng)基；替普瑞酮組，加入50 μmol/L的替普瑞酮和RPMI 1640培養(yǎng)基。作用24 h后，收集細胞。

1.5EMT相關蛋白E-cadherin和Vimentin的Westernblot檢測將A549細胞接種到6孔板中，待細胞融合達80%后，清洗細胞，并根據1.4中實驗分組進行相應處理。24 h后，收集細胞，用含PMSF的裂解液提取蛋白，將蛋白質樣品與上樣緩沖液混合煮沸5 min變性。之后進行SDS-PAGE電泳，電轉移至PVDF膜。PVDF膜用50 g/L脫脂奶粉混合TBST緩沖液封閉2 h，4 ℃下與一抗孵育12 h，用TBST緩沖液漂洗后加入二抗，置于搖床上常溫慢速孵育 2 h，洗膜后用超敏ECL化學發(fā)光顯色試劑顯影并曝光。利用Quantity One軟件定量分析條帶的灰度值。以目的蛋白與內參蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.6遷移能力檢測將A549細胞接種到到6孔板中，待細胞融合達80%后，用槍頭在6孔板中間細胞表面做一條劃痕，用PBS緩沖液清洗3遍，并在顯微鏡(×100)下觀察細胞形態(tài)及劃痕寬度，不同組別分別處理24 h，再于顯微鏡下進行觀察并拍照，對圖片用Photoshop軟件進行分析，結果用相對寬度來表示。

1.7統(tǒng)計學處理采用SPSS 21.0進行分析。不同濃度替普瑞酮誘導A549細胞后的細胞活性、4組細胞EMT相關蛋白表達和細胞遷移能力的比較采用2×2析因設計的方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1替普瑞酮最佳作用條件與0 μmol/L替普瑞酮處理比較，20、50 μmol/L替普瑞酮處理的A549細胞HSP70的表達升高(圖1、表1)；結合不同濃度替普瑞酮處理對細胞活性的影響，選擇50 μmol/L的替普瑞酮進行后續(xù)實驗。

1～5：分別為0、25、50、100和200 μmol/L的替普瑞酮處理

表1 不同濃度替普瑞酮處理對A549細胞HSP70表達和細胞活性的影響(n=3 )

2.2 4組A549細胞EMT相關蛋白表達的比較見圖2、表2。替普瑞酮促使A549細胞E-cadherin蛋白表達升高，Vimentin蛋白表達下降；TGF-β促使E-cadherin蛋白表達降低，Vimentin蛋白表達升高。替普瑞酮可拮抗TGF-β的作用。

1～4：分別為對照組、TGF-β組、TGF-β+替普瑞酮組和替普瑞酮組

2.3 4組細胞遷移能力比較見表2。TGF-β促使A549細胞遷移能力增強；替普瑞酮促使細胞遷移能力下降；替普瑞酮可拮抗TGF-β的作用。

表2 4組細胞EMT相關蛋白表達和細胞遷移能力的比較(n=3)

3 討論

目前，肺癌在全球范圍內的病例和死亡人數依然呈上升趨勢，肺癌細胞的轉移擴散是導致肺癌患者死亡的首要原因[1]。因此，控制肺癌細胞向機體其他器官的遷移和擴散是治療肺癌的重要措施[12]。EMT是肺癌細胞遷移發(fā)生的關鍵點，這個過程中胞質骨架會重新構建，細胞間的連接能力減弱，進而促進了細胞的遷移[13]。目前的研究[14-15]表明，EMT在多種細胞的遷移過程起到了很大的作用。

本研究結果顯示25、50 μmol/L替普瑞酮處理的A549細胞中HSP70蛋白的表達均升高；結合不同濃度替普瑞酮處理對A549細胞活性的影響，我們選擇50 μmol/L替普瑞酮進行后續(xù)的實驗。

HSP70作為HSP家族的核心成員而被廣泛研究，作為分子伴侶它參與蛋白的折疊、成熟過程。研究[16]發(fā)現，在大鼠腹膜間質細胞中，HSP70能作用于MAPK/ERK和TGF-β/SMAD信號通路，進一步抑制由糖基化最終產物誘導的細胞EMT進程；HSP70也能通過減弱TGF-β介導的SMAD2磷酸化進而調控HEK293T和HaCaT細胞的EMT進程[17]，因此我們推測高表達的HSP70對A549細胞的EMT進程也起到抑制作用。EMT進程中，常伴隨著E-cadherin蛋白表達降低而Vimentin蛋白表達增加[3]。本研究結果顯示，TGF-β促使A549細胞E-cadherin蛋白表達降低，Vimentin蛋白表達升高；替普瑞酮拮抗了這一作用。HSP70或許成為一個可以調控的潛在靶點進而影響A549細胞的EMT進程。

有研究[18]表明，HSP70參與了細胞的遷移進程，如在HeLa細胞中，沉默HSP70 的表達能促進細胞的遷移[19]；在人肺動脈內皮細胞中，高表達的HSP70能夠有效抑制細胞內活性氧的產生進而抑制細胞的遷移作用[20]；但是在膠質瘤細胞中，HSP70的高表達對細胞的遷移有著促進作用[21]，可能是不同種類的細胞導致的差異。本研究結果顯示，TGF-β促使A549細胞遷移能力增強，替普瑞酮拮抗了這一作用，這與在HeLa細胞和人肺動脈內皮細胞中的實驗結果是一致的，提示HSP70可能作為抑制細胞遷移的重要靶點。

綜上所述，在TGF-β誘導的A549細胞模型中，高表達的HSP70能抑制A549細胞EMT進程，并減弱細胞遷移能力。