林琴琴，王湘怡，耿元文，李若明，田振軍

組蛋白去乙酰化酶Sirtuin1（SⅠRT1），NAD+依賴性去乙?；福瑢儆冖瘼瘼耦惤M蛋白/蛋白質去乙酰酶，是沉默信息調節(jié)者2（silent information regulator 2，Sir2）家族成員之一[1]。SⅠRT1在細胞凋亡、衰老和代謝等多種細胞過程中發(fā)揮關鍵作用[2]。新近研究證實SⅠRT1是腎臟疾病治療的新靶點[3]，SⅠRT1激活可抑制腎臟細胞凋亡，減緩糖尿病腎病、造影劑或脂多糖導致的急性腎損傷（Acute kidney injury，AKⅠ）[4-6]。研究[7-8]證實SⅠRT1介導下游靶標包括叉頭框轉錄因子O3a（Forkhead box O3a，FoxO3a），其促進細胞存活、細胞凋亡和炎癥等。體內外實驗[9]結果均證實SⅠRT1激活顯著降低2型糖尿病小鼠腎臟皮質及高糖誘導人腎小球內皮細胞中FoxO3a表達，降低腎臟細胞凋亡，減緩糖尿病腎病的發(fā)生。SⅠRT1沉默可顯著增加HK-2細胞中高糖誘發(fā)的氧化應激及FoxO3a過表達[10]，因此SⅠRT1/FoxO通路可能成為預防和治療腎臟損傷的潛在靶標。文獻[11]表明運動對腎臟損傷保護具有良好效果。有氧運動可顯著降低急性缺血腎損傷大鼠腎臟腎小管損傷程度，抑制細胞凋亡，提升腎臟功能。研究[12-13]發(fā)現有氧運動可顯著提高心肌梗死（myocardial infarction，MⅠ）大鼠心肌或衰老大鼠骨骼肌中SⅠRT1表達，抑制細胞凋亡。間歇運動較有氧運動更有效保護腎臟功能[14-15]。但間歇運動是否激活MⅠ大鼠腎臟SⅠRT1/FoxO通路，抑制腎臟細胞凋亡，保護腎臟功能，目前尚無文獻報道。

微小RNA（MicroRNAs，miRs）是長度約22個核苷酸的內源性非編碼RNA，通過對靶mRNA的3'非翻譯區(qū)的互補序列退火，促進其降解或抑制翻譯過程[16]，進而調控細胞增殖分化、凋亡和免疫反應等多種生物學進程[17-19]。此外，它們還通過靶向相關基因作為缺血性腎病發(fā)展和進程的預后標志物[20-21]。研究[22]證實miR-155上調表達在缺血再灌注（ischemia/reperfusion，Ⅰ/R）誘導AKⅠ大鼠腎臟和缺氧復氧損傷（hypoxia-reoxygenation injury，HRⅠ）大鼠腎小管導管上皮細胞中，且其過表達促進細胞凋亡并抑制細胞增殖，而抑制miR-155表達發(fā)揮相反作用。最新研究[23]證實抑制Ⅰ/R小鼠心肌miR-155高水平表達，靶向上調SⅠRT1表達，進而抑制心肌細胞凋亡，減少梗塞面積，促進心功能。有氧運動可顯著降低乳腺癌或冠心病患者血清miR-155表達[24-25]。但間歇運動是否通過miR-155/SⅠRT1通路參與MⅠ后腎臟細胞凋亡的調節(jié)，尚未見文獻報道，因此，本研究擬探討間歇運動對MⅠ大鼠腎臟miR-155及其下游通路SⅠRT1/FoxO3a表達和腎臟細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 動物分組與MI模型制備

36只3月齡雄性SD大鼠，初始體重為180～220 g，由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供（動物質量合格證號：陜醫(yī)動證字SCXK2012-098），分籠飼養(yǎng)，自由飲食水，室溫20～29℃，濕度50%～60%。適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為假手術組（Sham組）、心肌梗死組（MⅠ組）和心梗+間歇有氧運動組（ME組），每組12只。各心梗組采用左冠狀動脈前降支（LAD）結扎造模。術前腹腔注射5%戊巴比妥鈉麻醉，開胸暴露心臟，結扎LAD，觀察結扎遠端心肌顏色變淺或變白，心電圖S-T段抬高或T波倒置，即為MⅠ模型造模成功，后逐層縫合關胸。為排除手術因素干擾，Sham組手術過程同上，但僅穿線不結扎LAD。

1.2 間歇有氧運動方案

ME組大鼠在術后1周開始訓練，運動方案參考WⅠSLOFF等的訓練模型[26]。適應性訓練1周（10～15 m/min，30 min/天，共5天）。正式訓練起始速度10 min×10 m/min（40%～50%·VO2max）熱身，以7 min×25 m/min（85%～90%VO2max）和3 min×15 m/min（50%～60%VO2max）交替進行大中等強度間歇運動?？倳r間為60 min，每周訓練5天，連續(xù)訓練4周。上述運動方案無大鼠死亡。

1.3 Western blot

腎臟組織勻漿后，RⅠPA提取總蛋白，BCA試劑盒定量。取40μg蛋白經10%～12%SDS-PAGE分離后，轉至PVDF膜，3%BSA室溫封閉后，加入一抗Bax（Abcam，1：5 000）、FoxO3a（Abcam，1：5 000）、caspase-3（Abcam，1：1 000）、SⅠRT1（Abcam，1：1 000）、Bcl-2（Affinity，1：1 000）、cleaved-caspase-3（Affinity，1：1 000）和GAPDH（1：8 000），4℃過夜，復溫后，加入二抗（1：10 000）孵育1 h，充分洗滌后，ECL發(fā)光成像。利用Bio-Rad多色凝膠成像系統(tǒng)圖像分析軟件Ⅰmage Lab Software 5.2進行分析處理。

1.4 RT-qPCR

腎臟組織勻漿后，TRⅠzol（Ⅰnventragtion）提取總RNA，反轉錄合成cDNA后，進行PCR擴增。引物序列 如 下 ：SⅠRT1上 游 引 物 ：5'-CAGTTCCAGCCATCTCTGTG-3'，下 游 引 物 ：5'-GCAACCTGCTCCAAGG TATC-3'；GAPDH上游引物：5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3'，下游引物：5'-TTTGAGGGTGCAGCG AACTT-3'。樣品重復3次檢測。利用2-△△Ct相對定量法計算SⅠRT1相對表達量，用內參GAPDH對其進行標準化。

TRⅠzol提取腎臟和血清總RNA，按microRNA反轉錄試劑（TAKARA）說明合成cDNA，以此cDNA為模板進行PCR反應。引物序列如下：miR-155上游引物 ：5'-TTAATGCTAATTGTGATAGGGGF-3'，下 游 引物：mRQ3'Primer。每個樣品重復3次檢測。運用2-△△Ct相對定量法計算miR-155的相對表達量，用內參U6對其進行標準化。

1.5 數據采集與統(tǒng)計學處理

所有數據均采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行處理，數據結果以均數±標準差表示。采用單因素方差分析（One-way Analysis of Variance，ANOVA）進行統(tǒng)計學分析，多重比較使用LSD檢驗。P＜0.05表示顯著性差異，P＜0.01表示極顯著性差異。

2 研究結果

2.1 心電圖記錄結果

結果顯示Sham組心電圖各波段規(guī)則正常；MⅠ后心電圖S-T段抬高或T波倒置，判定造模成功；ME組心電圖趨于正常，表明間歇運動對大鼠MⅠ模型是安全有效的（見圖1）。

圖1 各組大鼠心電圖變化Figure1 The Changes of ECG in Each Group of Rats

2.2 腎臟及血液miR-155表達結果

RT-qPCR結果顯示與Sham組比較，MⅠ組腎臟和血液mi R-155表達均顯著增加（分別為P＜0.05，P＜0.01）。與MⅠ組比較，ME組腎臟及血液miR-155表達均顯著減少（P＜0.01）（見圖2）。

圖2 各組大鼠腎臟及血液miR-155表達變化Figure 2 The Changes of miR-155 Expression in Kidney and Blood of Rats

2.3 腎臟SIRT1表達結果

RT-qPCR和Western blot結果顯示與Sham組比較，MⅠ組腎臟SⅠRT1 mRNA和蛋白表達均顯著減少（P＜0.01）。與MⅠ組比較，ME組腎臟SⅠRT1 mRNA和蛋白表達均顯著增加（P＜0.01）（見圖3）。

圖3 各組大鼠腎臟SIRT1 mRNA和蛋白表達變化Figure3 The Changes of SIRT1 mRNA and Protein Expression in Kidney of Rats

2.4 腎臟FoxO3a表達結果

Western blot結果顯示與Sham組比較，MⅠ組腎臟FoxO3a蛋白表達明顯增多（P＜0.01）。與MⅠ組比較，ME組腎臟FoxO3a蛋白表達顯著減少（P＜0.01）（見圖4）。

圖4 各組大鼠腎臟FoxO3a表達變化Figure4 The Changes of FoxO3a Expression in the Kidney of Rats

2.5 腎臟Bax、Bcl-2和Caspase-3表達結果

Western blot結果顯示與Sham組比較，MⅠ組腎臟Bcl-2表達顯著減少（P＜0.01），Bax表達顯著增加（P＜0.01），Bcl-2/Bax比值顯著降低（P＜0.01），Caspase-3和cleaved-Caspase-3表達顯著增加（P＜0.01）。與MⅠ組比較，ME組腎臟Bcl-2表達顯著增加（P＜0.01），Bax表達顯著減少（P＜0.01），Bcl-2/Bax比值顯著升高（P＜0.01），Caspase-3和cleaved-Caspase-3表達顯著減少（P＜0.01）（見圖5）。

2.6 腎臟miR-155表達與SIRT1、FoxO3a、細胞凋亡變化的相關性

相關性分析結果顯示腎臟SⅠRT1蛋白表達與FoxO3a、cleaved-caspase-3和Bax蛋白表達呈顯著負相關（r=-0.972，P＜0.01；r=-0.967，P＜0.01；r=-0.966，P＜0.01），與Bcl-2蛋白表達呈顯著正相關（r=0.880，P＜0.01），表明隨著腎臟SⅠRT1表達的增加，MⅠ大鼠腎臟細胞凋亡減少。MⅠ及MⅠ間歇運動后，腎臟miR-155表達與SⅠRT1蛋白表達呈顯著負相關（r=-0.889，P＜0.01），與FoxO3a、cleaved-caspase-3和Bax蛋白表達呈顯著正相關（r=0.802，P＜0.01；r=0.768，P＜0.05；r=0.772，P＜0.05），與Bcl-2蛋白表達呈顯著負相關（r=-0.994，P＜0.01），表明大鼠腎臟miR-155表達與腎臟細胞凋亡密切關系。

圖5 各組大鼠腎臟Bax、Bcl-2和caspase-3表達變化Figure 5 The Changes of Bax，Bcl-2 and caspase-3 Expression in the Kidney of Rats

3 分析與討論

臨床研究[27]發(fā)現AKⅠ在ST段抬高心?；颊咧邪l(fā)生率高達55%，是患者并發(fā)心源性休克的獨立死亡因素之一。大量研究[28-30]證實細胞凋亡在心梗導致AKⅠ的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。S.PASTORⅠ等[30]研究證實了急性心衰伴AKⅠ患者腎臟細胞凋亡程序的初始激活過程，結果發(fā)現與急性心力衰竭患者和健康人群相比，急性心衰伴AKⅠ患者腎臟腎小管上皮細胞磷脂酰絲氨酸易位至細胞膜外部，DNA片段化，caspase-8、caspase-9和caspase-3激活；更為重要的是，研究發(fā)現急性心衰伴AKⅠ患者腎臟雙重凋亡途徑激活，通過相同執(zhí)行途徑導致caspase-3激活，誘發(fā)細胞凋亡進程。結果表明腎臟細胞凋亡在心梗導致AKⅠ的機制中起重要作用，且其可能是潛在治療靶點。本研究結果顯示MⅠ大鼠腎臟Bcl-2表達減少，Bax表達增加，Bcl-2/Bax比值降低，caspase-3和cleaved-caspase-3蛋白表達增多。表明MⅠ誘發(fā)腎臟細胞凋亡進程。眾所周知有氧運動具有抗凋亡作用[31-33]。持續(xù)有氧運動可顯著抑制高脂膳食大鼠心肌細胞凋亡[31]，阻止肥胖大鼠生殖細胞凋亡[32]，減少腎臟Ⅰ/R大鼠腎臟細胞凋亡[33]。另研究證實間歇運動可顯著減少高脂膳食小鼠海馬神經細胞凋亡，減緩小鼠認知功能障礙[34]；抑制MⅠ大鼠腓腸肌細胞凋亡，逆轉MⅠ引起的骨骼肌萎縮[35]。新近研究發(fā)現與持續(xù)有氧運動相比，間歇運動更顯著抑制MⅠ大鼠心肌細胞凋亡[36]和肺動脈高壓大鼠右心室細胞凋亡[37]。提示間歇運動具有顯著抗凋亡作用，且優(yōu)于持續(xù)有氧運動干預效果。P.S.TUCKER等[14-15]研究發(fā)現與持續(xù)有氧運動相比，間歇運動更顯著減少早期慢性腎臟病大鼠血管緊張素原和炎癥因子mRNA表達，提高腎臟重量，增加腎臟特異內源性抗氧化酶活性相關基因mRNA的表達。說明間歇運動較持續(xù)有氧運動更有效發(fā)揮腎臟保護作用。本實驗結果顯示間歇運動可顯著抑制MⅠ大鼠腎臟Bax蛋白表達，增加Bcl-2蛋白表達，升高Bcl-2/Bax比值，降低caspase-3和cleaved-caspase-3蛋白表達，表明間歇運動顯著抑制心梗腎臟細胞凋亡，發(fā)揮腎臟保護作用。但其機制如何?

研究證實SⅠRT1激活在應激條件下保護心臟和腎功能[38-39]，而其缺乏與心血管和腎臟疾病的病理生理變化密切相關[40-41]。大量研究表明SⅠRT1具有重要的抗凋亡作用。本研究結果顯示MⅠ大鼠腎臟SⅠRT1 mRNA和蛋白表達顯著降低。提示SⅠRT1表達降低增加MⅠ腎臟細胞凋亡，加速腎臟損傷相關疾病進程。體內外研究[41]進一步證實鏈脲佐菌素誘導糖尿病大鼠腎臟和高糖誘導人腎小管上皮細胞中SⅠRT1表達降低，細胞凋亡增多。結果表明腎臟損傷促進SⅠRT1的失活可能是細胞凋亡進程的環(huán)節(jié)之一。提示激活SⅠRT1，降低細胞凋亡，提升腎功能。研究[41]證實SⅠRT1激活可顯著抑制糖尿病大鼠腎臟和高糖誘導人腎小管上皮細胞中cleaved caspase-3的表達，抑制腎臟細胞凋亡，提升細胞活性和腎臟組織功能。本研究結果顯示間歇運動后MⅠ大鼠腎臟SⅠRT1 mRNA和蛋白表達顯著增加，caspase-3和cleaved-caspase-3蛋白表達顯著降低，提示間歇運動激活SⅠRT1，降低MⅠ腎臟細胞凋亡，提升腎功能。眾所周知FoxO是SⅠRT1介導的下游靶標[42]，在許多細胞過程中發(fā)揮重要作用，包括增殖，分化和凋亡。研究[43]證實，SⅠRT1抑制FoxO3a表達，誘導細胞死亡。錳增強大鼠嗜鉻細胞瘤細胞和小鼠腦組織中SⅠRT1蛋白降解并下調其基因表達，增加FoxO3a表達，劑量依賴性誘導細胞凋亡[44]。本研究結果顯示MⅠ導致大鼠腎臟SⅠRT1表達降低，FoxO3a表達增加，細胞凋亡增多。表明SⅠRT1/FoxO3a通路是調控細胞凋亡的重要通路。研究證實SⅠRT1激活或過表達可顯著減弱錳誘導嗜鉻細胞瘤細胞[9]、2型糖尿病小鼠腎臟皮質及高糖誘導人腎小球內皮細胞[1]和過氧化氫誘導人來源內皮祖細胞[45]中FoxO3a表達，抑制細胞凋亡。本研究結果顯示間歇運動可顯著增加MⅠ大鼠腎臟SⅠRT1表達，降低FoxO3a表達，且腎臟SⅠRT1蛋白表達與FoxO3a、cleaved-caspase-3和Bax蛋白表達呈顯著負相關，與Bcl-2蛋白表達呈顯著正相關。結果說明間歇運動可激活MⅠ大鼠腎臟SⅠRT1/FoxO3a通路，抑制腎臟細胞凋亡。

近來研究[19]證實miRs已成為許多生物進程的調節(jié)者。mi Rs的過度表達是各種疾病中的常見現象，且其異常表達參與缺血性腎病等特定疾病的發(fā)病機理[46]。miR-122上調表達在腎臟Ⅰ/R模型及腎小管上皮細胞中，誘發(fā)細胞凋亡，損傷腎功能；抑制miR-122表達可抑制細胞凋亡，減緩Ⅰ/R損傷[47]。另研究[22，48]證實腎Ⅰ/R大鼠腎組織及HRⅠHK2和NRK-52E細胞中，miR-155的表達水平明顯上調，且其上調表達促進HRⅠHK2和NRK-52E細胞的細胞凋亡，而抑制miR-155表達，減少腎臟細胞凋亡，緩解腎臟損傷。本研究結果顯示，MⅠ大鼠腎臟和血液miR-155表達顯著增多，腎臟細胞凋亡增多；間歇運動顯著減少MⅠ大鼠腎臟和血液miR-155表達，降低腎臟細胞凋亡。說明間歇運動調節(jié)MⅠ腎臟miR-155表達，抑制腎臟細胞凋亡。另研究證實SⅠRT1是miR-155下游靶向蛋白，miR-155靶向抑制SⅠRT1表達，調節(jié)T細胞分化，增加炎癥反應，擴大疼痛[49]；調節(jié)腎臟細胞自噬，擴大糖尿病腎臟損傷[50]。最新研究發(fā)現miR-155靶向抑制SⅠRT1表達，增加心肌細胞凋亡數量，擴大梗死面積，減弱心臟功能；而抑制miR-155表達，SⅠRT1表達增加，梗塞面積減少，心肌細胞凋亡數量降低，心臟功能得到提升[23]。本研究結果顯示MⅠ大鼠腎臟miR-155表達增多，SⅠRT1表達減少，腎臟細胞凋亡數量增加。間歇運動大鼠腎臟miR-155表達減少，SⅠRT1表達增多，腎臟細胞凋亡降低，且腎臟mi R-155表達與SⅠRT1蛋白表達呈顯著負相關，與FoxO3a、cleaved-caspase-3和Bax蛋白表達呈顯著正相關，與Bcl-2蛋白表達呈顯著負相關。提示間歇運動可能通過抑制心梗大鼠腎臟miR-155表達，激活其下游信號通路SⅠRT1/FoxO3a。推測間歇運動抑制MⅠ大鼠腎臟細胞凋亡，發(fā)揮腎臟保護效應，其機制與miR-155/SⅠRT1/FoxO3a通路激活密切相關。

4 結論

間歇運動可顯著抑制心梗大鼠腎臟miR-155表達，增加SⅠRT1，降低FoxO3a、cleaved-caspase-3和Bax的表達，增加Bcl-2的表達，抑制腎臟細胞凋亡。推測MⅠ腎臟功能改善和腎臟mi R-155表達降低及下游信號通路SⅠRT1/FoxO3a激活關系密切。表明間歇運動可能通過激活腎臟miR-155/SⅠRT1/FoxO3a信號通路，抑制其細胞凋亡，顯著改善MⅠ大鼠腎臟功能。