向 陽，劉 雁，禹利君*，徐詩鈺，賀軍輝，劉仲華，王坤波，劉亞玲

1. 永順縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，湖南 永順 416700；2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128；3. 湖南華萊生物科技有限公司，湖南 益陽 413513

“金花”散茶采用冠突散囊菌（俗稱“金花”）調(diào)控發(fā)花，產(chǎn)生眾多微生物代謝產(chǎn)物[1]，與黑毛茶、黃茶、白茶等輕發(fā)酵茶風(fēng)味明顯不同；與發(fā)花前黑毛茶樣相比，湯色上增加了紅色、橙色，滋味上減少了澀度、增加了甜度。金花越茂盛，茶湯色澤向橙紅轉(zhuǎn)變?cè)斤@著、滋味回甘度越明顯[2-3]?！敖鸹ā鄙⒉柚械目扇苄蕴妓衔飳?duì)代謝綜合癥及腸道菌群有很好的改善作用[4-6]。當(dāng)前茶葉可溶性碳水化合物的提取測(cè)定，習(xí)慣沿用“茶樣熱水浴浸提45 min的蒽酮比色法”[7]，對(duì)于金花茂盛的新型發(fā)花茶類，該方法是否能實(shí)現(xiàn)可溶性碳水化合物的準(zhǔn)確測(cè)定，未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)以“茶樣熱水浴浸提45 min”為對(duì)照，分別比較了常規(guī)沸水浴浸提、超聲波輔助浸提、索氏回流浸提等三種方法對(duì)“金花”天尖散茶及二級(jí)黑毛茶加工的“金花”散茶的浸提效果，為“金花”散茶中可溶性碳水化合物的提取及準(zhǔn)確測(cè)定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)長安茶學(xué)教學(xué)實(shí)習(xí)基地2019年春季學(xué)生教學(xué)實(shí)習(xí)制備的黑茶天尖原料及“金花”天尖散茶、湖南華萊生物科技有限公司提供的2019年夏季二級(jí)黑毛茶及以此原料制備的“金花”散茶。

1.2 主要儀器及試劑

島津UV-1800紫外可見分光光度計(jì)、湘儀TD5S-WS離心機(jī)、昆山美美KQ-3200E超聲波清洗器、鈺楊60 mL微型索氏提取裝置、德爾微型粉碎機(jī)等。蒽酮、濃硫酸、石油醚、乙醇等試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；茶湯浸泡用水為怡寶純凈水。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 可溶性碳水化合物反應(yīng)體系優(yōu)選

1.3.2 可溶性碳水化合物浸提方法

（A）常規(guī)水浴浸提

（B）超聲波輔助浸提

（C）索氏水浴回流浸提

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

測(cè)試反應(yīng)體系3次平行，A、B、C三種浸提方式兩次重復(fù)，Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，可溶性碳水化合物含量以meanSD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒽酮反應(yīng)體系優(yōu)化

2.1.1 蒽酮反應(yīng)體系對(duì)總可溶性碳水化合物含量測(cè)定的影響

葡萄糖對(duì)照品濃度梯度為 25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL、250 μg/mL，分別進(jìn)行0.6%蒽酮硫酸溶液8 mL反應(yīng)體系a、0.33%蒽酮硫酸溶液4 mL反應(yīng)體系b。反應(yīng)體系a葡萄糖對(duì)照品吸光度平均值依次為 0.084、0.156、0.317、0.481、0.645和 0.809，一元線性回歸方程為 y = 0.0032x - 0.0029（R2 = 0.9998），對(duì)（A）常規(guī)水浴浸提的黑毛茶進(jìn)行測(cè)定，其吸光度平均值依次為0.180、0.178、0.185、0.179、0.187、0.190，在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍之內(nèi)。反應(yīng)體系b葡萄糖對(duì)照品吸光度平均值依次為0.257、0.469、0.906、1.324、1.698和2.171，一元線性回歸方程為 y = 0.0084x + 0.0061（R2 = 0.9995），對(duì)（C）索氏水浴回流浸提的“金花”茶樣進(jìn)行測(cè)定，其吸光度平均值依次為1.007、1.010、1.010、0.991、1.012和0.992，在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍之內(nèi)。由此可知，采用0.33%蒽酮硫酸不僅可獲得良好的葡萄糖對(duì)照品及樣品測(cè)定，同時(shí)還可減少硫酸用量，避免硫酸的潛在危害。

2.1.2 茶湯稀釋倍數(shù)的影響

黑毛茶、黃茶、白茶等輕發(fā)酵茶其總可溶性碳水化合物蒽酮反應(yīng)經(jīng)驗(yàn)體系為：3.0 g茶水浴浸提 45 min 后定容至 500 mL，取 1 mL 茶湯進(jìn)行反應(yīng)測(cè)定[7]。發(fā)花茶類因“金花”參與了茶葉代謝產(chǎn)物的深度轉(zhuǎn)化，茶湯滋味甜度明顯增加，色澤較黑毛茶、黃茶、白茶等輕發(fā)酵茶茶湯色澤明顯加深，預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)直接取用1 mL茶湯反應(yīng)其吸光度超出了標(biāo)準(zhǔn)曲線有效范圍。配制濃度梯度 25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL、250 μg/mL 葡萄糖對(duì)照品，以反應(yīng)體系b進(jìn)行A620 nm吸光度測(cè)定，其平均值依次為0.058、0.102、0.201、0.303、0.401 和0.489，一元線性回歸方程為 y = 0.0019x + 0.0082（R2 = 0.9995）。測(cè)試樣品茶湯經(jīng)不同稀釋倍數(shù)比較發(fā)現(xiàn)，天尖、二級(jí)黑毛茶及其“金花”散茶其茶湯稀釋倍數(shù)以5 ～ 10倍為宜。由此可知，茶葉后發(fā)酵程度不同導(dǎo)致了茶葉中可溶性碳水化合物含量不同，蒽酮測(cè)試反應(yīng)體系其茶湯稀釋倍數(shù)也需對(duì)應(yīng)調(diào)整，才能得到可靠的測(cè)定結(jié)果。

2.1.3 活性碳對(duì)葡萄糖及茶湯中總可溶性碳水化合物吸附的影響

與超聲波輔助浸提、索氏水浴回流浸提方法比較，常規(guī)水浴浸提沒有添加石油醚去脂、乙醇去蛋白，僅100℃沸水浴45 min，選擇加入適量活性碳（料液比1∶100）對(duì)茶湯中色素進(jìn)行吸附，以減少色素物質(zhì)對(duì)總可溶性碳水化合物測(cè)定的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：選取150 μg/mL葡萄糖對(duì)照品溶液100 mL、加入0.5 g活性炭、120 r/min振蕩回旋30 min后進(jìn)行蒽酮比色法測(cè)定，葡萄糖回收率為94.15% ～ 106.44%，說明活性碳對(duì)葡萄糖吸附作用不明顯；對(duì)天尖及二級(jí)黑毛茶發(fā)花的“金花”散茶浸提液參照葡萄糖對(duì)照品處理方式進(jìn)行活性碳吸附，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可溶性碳水化合物含量下降了65.99% ～ 76.95%。由此推知，茶湯中可溶性碳水化合物與色素物質(zhì)緊密結(jié)合，在去除色素的同時(shí)也帶走了可溶性糖。可見，活性炭不適合在測(cè)試樣品茶湯中添加。

2.2 不同浸提方法對(duì)天尖及“金花”天尖散茶可溶性碳水化合物含量的影響

以不同浸提方法進(jìn)行“金花”天尖散茶及天尖原料浸提，提取液稀釋5倍，進(jìn)行反應(yīng)體系b即4 mL 0.33%蒽酮-硫酸體系比色法測(cè)定。表1測(cè)定結(jié)果可知，三種浸提方式顯示經(jīng)發(fā)花后可溶性碳水化合物含量均極顯著增加；對(duì)天尖及“金花”天尖散茶而言，超聲波輔助浸提與常規(guī)水浴浸提效率相當(dāng)；索氏水浴回流浸提時(shí)間長達(dá)2.5 h，其可溶性碳水化合物含量也最高，分別達(dá)到6.45%和9.96%，但每批次處理樣品少。綜合分析可知，若樣品少，為實(shí)現(xiàn)可溶性碳水化合物含量精準(zhǔn)測(cè)定，索氏水浴回流浸提為最優(yōu)方法；若樣品量大，為比較實(shí)驗(yàn)處理導(dǎo)致的可溶性碳水化合物含量差異，常規(guī)水浴浸提、超聲輔助浸提為首選，但超聲輔助浸提每批次處理的樣品量更大，能耗更低。

2.3 不同浸提方法對(duì)二級(jí)黑毛茶及其“金花”散茶可溶性碳水化合物含量影響

以不同浸提方法進(jìn)行二級(jí)黑毛茶及發(fā)花散茶茶樣浸提，提取液稀釋10倍，進(jìn)行反應(yīng)體系b測(cè)定。表2測(cè)定結(jié)果可知：超聲波輔助浸提、索氏水浴回流浸提更加有助于發(fā)花散茶中可溶性碳水化合物浸提，與其二級(jí)黑毛茶比較，差異均達(dá)到了極顯著水平；常規(guī)水浴浸提條件下其發(fā)花前后可溶性碳水化合物含量沒有顯著差異。由此可知，對(duì)于原料較粗老的茶葉及其加工出的“金花”黑茶產(chǎn)品，需要較長時(shí)間的索氏回流或超聲波輔助高效提取，才能獲得較高的可溶性碳水化合物浸提率。

表1 天尖及“金花”天尖散茶可溶性碳水化合物含量比較 （%）Table 1 Comparison of soluble carbohydrate extraction contents of Tianjian and “Jinhua” Tianjian loose tea （%）

表2 二級(jí)黑毛茶及其“金花”散茶中可溶性碳水化合物含量比較 （%）Table 2 Comparison of soluble carbohydrate extraction contents of 2th grade raw dark tea and its “Jinhua” loose tea（%）

3 討論

蒽酮-硫酸比色法是一種測(cè)定樣品中單糖、雙糖和多糖含量的常用方法，樣品中的糖類在濃硫酸作用下，脫水生成糠醛及其衍生物與蒽酮發(fā)生反應(yīng)呈藍(lán)綠色，顏色深淺不一，糖的含量也不相同；常規(guī)反應(yīng)體系以葡萄糖為對(duì)照品，1 mL 茶湯與 8 mL 0.6% 蒽酮 -硫酸溶液沸水浴8 min進(jìn)行比色測(cè)定，可實(shí)現(xiàn)茶葉中可溶性碳水化合物含量快速測(cè)定。為探究蒽酮反應(yīng)體系的濃度及適當(dāng)用量，王黎明等對(duì)純化的茶多糖進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，4 mL 0.05%的蒽酮-硫酸與1 mL純化的多糖溶液反應(yīng)，可獲得理想測(cè)定結(jié)果[8]；傅博強(qiáng)等對(duì)茶葉中多糖含量測(cè)定采用吸取1 mL茶湯與4 mL 0.33%蒽酮-硫酸溶液沸水浴7 min進(jìn)行反應(yīng)，取得了理想測(cè)試結(jié)果[8]。由此可知，減少蒽酮硫酸用量及濃度，對(duì)茶葉中可溶性糖測(cè)定是可行的。然而，可溶性糖在茶葉的配比組成存在差異，茶葉樣品是以葡萄糖為基本組成，但茶花等樣品是以半乳糖為基本組成。為此，以葡萄糖還是半乳糖作為檢測(cè)對(duì)照品，張海星等研究發(fā)現(xiàn)需根據(jù)原料情況選擇相應(yīng)分析測(cè)試體系[10]；本試驗(yàn)通過將常規(guī)反應(yīng)體系a與減少蒽酮-硫酸濃度及用量的反應(yīng)體系b進(jìn)行對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，采用反應(yīng)體系b對(duì)“金花”散茶及其發(fā)花原料可獲得良好測(cè)定結(jié)果，同時(shí)也減少了濃硫酸的用量。

黑茶原料經(jīng)冠突散囊菌發(fā)花產(chǎn)生了復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)及代謝產(chǎn)物，發(fā)花后的黑茶新增了油脂類、色素、可溶性碳水化合物等多種風(fēng)味物質(zhì)[1]。已有研究報(bào)道，為減少油脂對(duì)玫瑰葉中可溶性多糖含量測(cè)定結(jié)果的干擾，采用石油醚回流脫脂[11]；王雪媛等研究發(fā)現(xiàn)，肉蓯蓉油脂、蛋白含量極高，加入95%乙醇水浴回流2 h可減少對(duì)多糖含量測(cè)定結(jié)果的干擾[12]；茶葉經(jīng)冠突散囊菌發(fā)花后產(chǎn)生了較多的色素及油脂類物質(zhì)[1]，在劉雁等感官審評(píng)結(jié)果也得到了明顯體現(xiàn)[2]。從本試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果（表1、表2）分析可知，熱水浴浸提后茶湯中色素、油脂、蛋白沒有對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生干擾；活性碳對(duì)葡萄糖對(duì)照品吸附可以忽略不計(jì)，但加到茶湯中脫色會(huì)造成茶湯中糖類物質(zhì)大量被吸附，因此活性碳不宜添加到茶湯中。超聲波輔助浸提、索氏水浴回流浸提均采用石油醚脫脂、乙醇去蛋白，80%乙醇浸提離心棄上清。從測(cè)定結(jié)果（表1、表2）來看，與常規(guī)水浴浸提比較，超聲波輔助浸提量略有升高、索氏水浴回流浸提量明顯升高。因此，若僅是對(duì)大批量樣品進(jìn)行可溶性碳水化合物含量測(cè)定，為減少工作時(shí)間、節(jié)約能耗，超聲波輔助浸提為首選；若需準(zhǔn)確測(cè)定“金花”黑茶中可溶性碳水化合物含量，索氏水浴回流浸提盡管歷時(shí)長、操作繁瑣，不便于實(shí)現(xiàn)大批量樣品浸提，但可獲得可溶性碳水化合物含量的充分浸提以達(dá)到準(zhǔn)確測(cè)定。