劉 菲，徐晶晶，周 珺，韓 野

（蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.消化科；2.中心實(shí)驗(yàn)室；3.普外科，江蘇 蘇州 215006）

胃癌（gastric cancer, GC）是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居第四位，死亡率居第三位，僅次于肺癌和肝癌[1]。盡管目前胃癌的診斷和治療取得了重大進(jìn)展，早期胃癌患者的生存率得到了明顯提高，但進(jìn)展期胃癌的預(yù)后仍不是很理想，其5 年生存率仍不足20%，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍然是胃癌患者最主要的致死原因[2]。目前胃癌的治療方案還是以手術(shù)為主，輔以術(shù)后的放化療，但其術(shù)后復(fù)發(fā)率高，放化療效果不理想，生存率較低，尤其是晚期胃癌患者[3]。研究表明胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素的、多步驟的、復(fù)雜的過(guò)程，包括患者所身處的生活環(huán)境、飲食因素、遺傳因素，相關(guān)基因突變包括癌基因的激活、抑癌基因的失活等，均參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展，但其具體的分子機(jī)制仍不明確。因此，為了提高胃癌的早期診斷率并尋找新的更有效的治療方案，進(jìn)一步深入研究胃癌的發(fā)病機(jī)制刻不容緩。

MicroRNA（miRNA）是近年發(fā)現(xiàn)的一類在生物體內(nèi)廣泛表達(dá)的、長(zhǎng)22～24 nt的、高度保守的非編碼調(diào)節(jié)性小分子RNA。它們可以通過(guò)抑制其靶基因mRNA的翻譯或直接將其降解，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，并可以進(jìn)一步調(diào)控其靶基因參與的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與調(diào)控哺乳動(dòng)物多個(gè)器官的發(fā)育過(guò)程和人類疾病的發(fā)生[4-5]。一個(gè)miRNA可以調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)，而幾個(gè)miRNA也可以調(diào)控某一個(gè)基因的表達(dá)，這說(shuō)明miRNA及其靶分子能夠形成龐大、錯(cuò)綜復(fù)雜的生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。研究[6-7]表明，miRNA參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞周期、增殖和凋亡、分化以及代謝等，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。在胃癌中，已發(fā)現(xiàn)多種異常表達(dá)的miRNA，其參與了胃癌的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過(guò)程，并通過(guò)調(diào)控各自不同的靶基因影響胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為[8]。

miR-17-92也稱為oncomiR-1，是最具代表性的發(fā)揮癌基因樣作用的miRNA之一，位于人類基因組第13號(hào)染色體上C13orf25基因初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的第3個(gè)內(nèi)含子區(qū)，其初級(jí)轉(zhuǎn)錄物編碼六種成熟的miRNA：miR-17，miR-18a，miR-19a，miR-19b-1，miR-20a和miR-92a-1[9-10]。已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-17-92基因簇在多種腫瘤中高表達(dá)，并促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，發(fā)揮著類似于癌基因樣的作用；也有少數(shù)研究[11]報(bào)道稱miR-17-92基因簇能抑制腫瘤的進(jìn)展，發(fā)揮著類似于抑癌基因樣的作用。然而，目前對(duì)于miR-17-92基因簇在胃癌發(fā)生發(fā)展中的研究報(bào)道尚不多。

目前臨床上對(duì)于胃癌的治療效果仍不理想，其主要難題是胃癌易發(fā)生轉(zhuǎn)移，其早期臨床癥狀不典型，早期診斷率較低，發(fā)現(xiàn)的時(shí)候大多數(shù)已到中晚期，因此miRNA無(wú)論在胃癌的早期診斷還是術(shù)后檢測(cè)方面均具有較為廣闊的前景。盡管已有研究[12]表明多種miRNA都具有潛在胃癌生物學(xué)標(biāo)志物的作用，但仍需進(jìn)一步的探索和臨床驗(yàn)證，同時(shí)還需建立一套標(biāo)準(zhǔn)化的體系以及miRNA大樣本的數(shù)據(jù)庫(kù)完善。本文通過(guò)研究miR-17-92基因簇在人胃癌組織中的表達(dá)水平，并分析其與胃癌患者臨床病理資料的相關(guān)性，隨后通過(guò)在胃癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-17-92，驗(yàn)證其對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲能力的影響，對(duì)miR-17-92的生物學(xué)功能進(jìn)行更加深入的研究，為胃癌的臨床診斷、治療及預(yù)后監(jiān)測(cè)提供新的策略和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、試劑和抗體 流式細(xì)胞儀FASCalibur購(gòu)自BD Biosciences公司；System Microscope IX7熒光倒置顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司；NanoDrop1000購(gòu)自Thremo公司；xCelligence細(xì)胞實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)、E-Plate/CIM-Plate培養(yǎng)板、LightCycler 480熒光定量PCR儀和FuGENE HD均購(gòu)自Roche公司；Odyssey熒光掃描成像系統(tǒng)購(gòu)自Li-COR公司；RPMI-1640和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；抗體AKT（#4691），p-AKT（Ser473，#4060），p-AKT（Thr308，#2965），ERK（#4695），pERK（#4370S），Integrin β1（#9699）購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；β-actin（AT0001）抗體購(gòu)自CMCTAG公司；嘌呤霉素（J539-25MG）購(gòu)自Amresco公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑M-MLV（28025-013）和合成引物購(gòu)自Invitrogen公司；SYBR Premix Ex Taq（RR420）購(gòu)自TaKaRa公司；Matrigel（356234）購(gòu)自BD Biosciences公司。

1.2 臨床資料 收集我院普外科2018年9月—2019年12月接受胃癌根治術(shù)患者的手術(shù)切除癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本共計(jì)30 例，手術(shù)切除后立即將其放置于液氮罐中保存。所有患者術(shù)前均未接受任何放療和化療，并簽署了相關(guān)知情同意書。臨床標(biāo)本的收集及使用獲得了蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 胃癌細(xì)胞株MGC-803為本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存，培養(yǎng)于含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，并在37 ℃，5% CO2及含飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。Phoenix A包裝細(xì)胞使用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。應(yīng)用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，2～3 d傳代一次，均選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR） Trizol裂解液一步法提取細(xì)胞總RNA，并用NanoDrop定量RNA濃度和質(zhì)量。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑說(shuō)明，利用M-MLV將2μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。qRT-PCR在LightCycler 480熒光定量PCR儀上進(jìn)行，每個(gè)反應(yīng)設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，40 個(gè)循環(huán)。以U6作為內(nèi)參，檢測(cè)每個(gè)反應(yīng)孔中熒光達(dá)到設(shè)定值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（即Ct值），基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平用2-△△Ct計(jì)算。引物序列用NCBI的PrimerBlast設(shè)計(jì)，具體引物序列見表1。

表1 qRT-PCR所用引物序列Tab.1 The primer sequences used in qRT-PCR analyses

1.5 建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的miR-17-92過(guò)表達(dá)細(xì)胞株 在35 mm培養(yǎng)皿中接種Phoenix A包裝細(xì)胞，使第2天細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染試劑為FuGENE HD，按照產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。使用包裝載體pCL和MSCV-GFP-miR-17-92共同轉(zhuǎn)染Phoenix A包裝細(xì)胞，18 h后通過(guò)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，更換新鮮培養(yǎng)基，48 h后收集病毒上清，并用此病毒上清轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞MGC-803。同時(shí)使用包裝載體pCL和空載體MSCV-GFP轉(zhuǎn)染MGC-803細(xì)胞作為對(duì)照。利用嘌呤霉素（5 μg/mL）篩選，最終獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。

1.6 xCELLigence系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)及侵襲 利用xCelligence系統(tǒng)和RTCA 1.2軟件進(jìn)行細(xì)胞指數(shù)（cell index）的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。“細(xì)胞指數(shù)”是由測(cè)得的電阻抗推算出的一個(gè)無(wú)量綱參數(shù)，它與黏附上去的細(xì)胞數(shù)量直接相關(guān)。當(dāng)系統(tǒng)專用的培養(yǎng)板（E-plate或CIM-plate）中未加細(xì)胞時(shí)，各個(gè)培養(yǎng)孔中的“細(xì)胞指數(shù)”相同，為起始空白值，當(dāng)加入細(xì)胞后，隨著細(xì)胞的貼壁和增殖生長(zhǎng)，由此產(chǎn)生的電阻抗信號(hào)產(chǎn)生變化，即細(xì)胞貼壁多，信號(hào)高，“細(xì)胞指數(shù)”數(shù)值大。實(shí)驗(yàn)按照儀器使用說(shuō)明書進(jìn)行，用E-plate培養(yǎng)板檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)，用CIM-plate培養(yǎng)板檢測(cè)細(xì)胞侵襲。

1.7 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 按照標(biāo)準(zhǔn)蛋白提取方法，使用RIPA裂解緩沖液提取細(xì)胞全蛋白。經(jīng)10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，半干轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上。用5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。PBST洗膜后，加入熒光二抗，室溫避光孵育45 min。最后用Odyssey熒光掃描成像系統(tǒng)進(jìn)行成像檢測(cè)。

1.8 明膠酶譜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MMP活性 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)24 h，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%后，更換無(wú)胎牛血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集培養(yǎng)上清液。取20μL上樣于8%聚丙烯酰胺凝膠（含1%明膠），電泳后，取出凝膠，置于復(fù)性液中孵育1 h，然后置于消化液中37 ℃孵育40 h，孵育結(jié)束后經(jīng)染色液染色1 h，再經(jīng)脫色液脫色，終止液終止脫色。最后顯示MMP-2、MMP-9為藍(lán)色背景上的透亮帶，干燥、封膠，拍照。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)值以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，運(yùn)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同實(shí)驗(yàn)組之間采用均數(shù)單因素方差分析或Student'st檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-17-92基因簇各亞單位在胃癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)差異 我們運(yùn)用qRT-PCR法分別檢測(cè)了miR-17-92基因簇的6個(gè)亞單位miR-17、miR-18、miR-19a、miR-19b、miR-20和miR-92在30 例胃癌組織及其對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織中的表達(dá)情況，如圖1所示：與癌旁正常組織相比，miR-17-92基因簇的6個(gè)亞單位在胃癌組織中的表達(dá)均顯著升高，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 qRT-PCR法檢測(cè)miR-17-92基因簇各亞單位在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)Fig.1 The expression pattern of each subunits of the miR-17-92 cluster in human gastric cancer tissues and the corresponding adjacent normal tissues were detected by qRT-PCR analyses

2.2 miR-17-92基因簇各亞單位的表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理資料的相關(guān)性分析 為了進(jìn)一步探討miR-17-92基因簇各亞單位的表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理資料的關(guān)系，我們對(duì)30 例胃癌患者的臨床病理資料進(jìn)行了亞組分析，其亞組分組指標(biāo)包括年齡、性別、腫瘤大小、分化程度及TNM分期。如表2所示：miR-17的表達(dá)水平在不同年齡（P＝0.6708）、不同性別（P＝0.5938）、不同腫瘤大?。≒＝0.7588）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在不同分化程度（P＝0.0031）、不同TNM分期（P＝0.0020）差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miR-18的表達(dá)水平在不同年齡（P＝0.6372）、不同性別（P＝0.6238）、不同腫瘤大?。≒＝0.3339）、不同分化程度（P＝0.1802）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在不同TNM分期（P＝0.0020）差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miR-19a的表達(dá)水平在不同年齡（P＝0.7216）、不同性別（P＝0.9089）、不同分化程度（P＝0.2841）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在不同腫瘤大?。≒＝0.0002）、不同 TNM 分期（P＝0.0012）差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miR-19b的表達(dá)水平在不同年齡（P＝0.5986）、不同性別（P＝0.7826）、不同分化程度（P＝0.8125）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在不同腫瘤大?。≒＝0.0072）、不同TNM分期（P＝0.0002）差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miR-20的表達(dá)水平在不同年齡（P＝0.6519）、不同性別（P＝0.6056）、不同腫瘤大小（P＝0.6011）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在不同分化程度（P＝0.0143）、不同 TNM 分期（P＝0.0023）差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miR-92的表達(dá)水平在不同年齡（P＝0.8661）、不同性別（P＝0.9336）、不同分化程度（P＝0.1888）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在不同腫瘤大?。≒＝0.0374）、不同TNM分期（P＝0.0035）差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 miR-17-92的表達(dá)與胃癌患者臨床病理資料的關(guān)系Tab.2 The relationship between the miR-17-92 cluster and clinicopathological features of gastric

2.3 構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-17-92基因簇的胃癌細(xì)胞株為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-17-92在MGC-803胃癌細(xì)胞株中的生物學(xué)功能，我們構(gòu)建了過(guò)表達(dá)miR-17-92的質(zhì)粒并運(yùn)用慢病毒上清將其轉(zhuǎn)染入MGC-803細(xì)胞中，并用嘌呤霉素篩選出了單克隆細(xì)胞。在熒光顯微鏡下觀察，我們發(fā)現(xiàn)MGC-803-control細(xì)胞及MGC-803-miR-17-92細(xì)胞均表達(dá)很強(qiáng)的綠熒光信號(hào)；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其熒光純度分別為95.88%及96.71%。用qRT-PCR法進(jìn)一步檢測(cè)了被篩選出來(lái)的單克隆細(xì)胞中miR-17-92的表達(dá)情況，我們發(fā)現(xiàn)MGC-803-miR-17-92細(xì)胞中miR-17-92家族各個(gè)成員的表達(dá)量均較MGC-803-control細(xì)胞顯著上調(diào)，如圖2所示，miR-17上調(diào)4倍，miR-18上調(diào)3倍，miR-19a上調(diào)6倍，miR-19b上調(diào)5倍，miR-20上調(diào)4倍，miR-92上調(diào)2倍，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。因此，我們成功構(gòu)建了穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-17-92基因簇的MGC-803胃癌細(xì)胞株。

圖2 qRT-PCR法檢測(cè)MGC-803-control細(xì)胞和MGC-803-miR-17-92細(xì)胞中miR-17-92基因簇的表達(dá)Fig.2 The mRNA expression levels of the miR-17-92 cluster between the MGC-803-control cells and the MGC-803-miR-17-92 cells were detected by qRT-PCR

2.4 過(guò)表達(dá)miR-17-92對(duì)MGC-803細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 接種8 000 個(gè)細(xì)胞/孔在E-plate，通過(guò)xCELLigence系統(tǒng)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)72 h。如圖3A所示，在起始的10 h內(nèi)，MGC-803-control細(xì)胞與MGC-803-miR-17-92細(xì)胞生長(zhǎng)速度無(wú)顯著差異，但從24 h開始兩組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線有了明顯的差異，縱坐標(biāo)細(xì)胞指數(shù)顯示的數(shù)值提示MGC-803-miR-17-92細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯快于MGC-803-control細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。因此過(guò)表達(dá)miR-17-92加快了MGC-803細(xì)胞的生長(zhǎng)。我們還檢測(cè)了兩組細(xì)胞中AKT信號(hào)通路的蛋白表達(dá)情況，如圖3B所示，MGC-803-control和MGC-803-miR-17-92細(xì)胞的全蛋白提取液中總AKT表達(dá)水平相似，但過(guò)表達(dá)miR-17-92促進(jìn)了AKT蛋白在蘇氨酸308位點(diǎn)的磷酸化，而對(duì)絲氨酸473位點(diǎn)的磷酸化無(wú)明顯影響。另外，我們還檢測(cè)了兩組細(xì)胞中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK1/2）的蛋白表達(dá)，如圖3C所示，兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但MGC-803-miR-17-92細(xì)胞中磷酸化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（p-ERK1/2）的蛋白表達(dá)顯著高于MGC-803-control細(xì)胞。因此，過(guò)表達(dá)miR-17-92在不影響ERK1/2蛋白表達(dá)的情況下上調(diào)了MGC-803細(xì)胞中ERK1/2蛋白的磷酸化。

圖3 過(guò)表達(dá)miR-17-92對(duì)MGC-803細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。A：xCELLigence系統(tǒng)監(jiān)測(cè)MGC-803-control細(xì)胞和MGC-803-miR-17-92細(xì)胞72 h生長(zhǎng)情況；B：Western blot法測(cè)定過(guò)表達(dá)miR-17-92對(duì)MGC-803細(xì)胞內(nèi)AKT信號(hào)通路的影響（β-Actin為上樣對(duì)照）；C：Western blot法測(cè)定過(guò)表達(dá)miR-17-92對(duì)MGC-803細(xì)胞內(nèi)ERK1/2信號(hào)通路的影響（β-Actin為上樣對(duì)照）。Fig.3 miR-17-92 overexpression affects cell growth of the MGC-803 cells. A: Cell growth of the MGC-803-control cells and the MGC-803-miR-17-92 cells were monitored by a real-time xCELLigence system; B: The protein expression levels of AKT signaling between the two established cell lines were measured by Western blot; C: The protein expression levels of ERK1/2 signaling between the two established cell lines were measured by Western blot.

2.5 過(guò)表達(dá)miR-17-92對(duì)MGC-803細(xì)胞侵襲的影響 接種50 000 個(gè)細(xì)胞/孔在CIM-plate，通過(guò)xCELLigence系統(tǒng)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)細(xì)胞侵襲24 h。如圖4A所示，在起始的9 h內(nèi)，MGC-803-control細(xì)胞與MGC-803-miR-17-92細(xì)胞的侵襲能力無(wú)顯著差異。但從12 h開始兩組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線有了明顯的差異，縱坐標(biāo)細(xì)胞指數(shù)顯示的數(shù)值提示MGC-803-miR-17-92細(xì)胞的侵襲能力明顯強(qiáng)于MGC-803-control細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。因此過(guò)表達(dá)miR-17-92顯著增強(qiáng)了MGC-803細(xì)胞的侵襲能力。我們用Western blot法檢測(cè)了兩組細(xì)胞中Integrin β1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)MGC-803-miR-17-92細(xì)胞中Integrin β1的表達(dá)水平顯著高于MGC-803-control細(xì)胞（圖4B）。此外，我們還用明膠酶譜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了兩組細(xì)胞中MMP的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MMP-9在兩組細(xì)胞中的活性均很低，而MMP-2在MGC-803-miR-17-92細(xì)胞中的活性顯著高于MGC-803-control細(xì)胞（圖4C）。

圖4 過(guò)表達(dá)miR-17-92對(duì)MGC-803細(xì)胞侵襲能力的影響。A：xCELLigence系統(tǒng)監(jiān)測(cè)MGC-803-control細(xì)胞和MGC-803-miR-17-92細(xì)胞24 h內(nèi)的侵襲能力；B：Western blot法測(cè)定過(guò)表達(dá)miR-17-92對(duì)MGC-803細(xì)胞內(nèi)Integrin β1蛋白表達(dá)的影響（β-Actin為上樣對(duì)照）；C：明膠酶譜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-17-92對(duì)MGC-803細(xì)胞內(nèi)MMPs活性的影響。Fig.4 miR-17-92 overexpression affects cell invasion ability of the MGC-803 cells. A: Cell invasion abilities of the MGC-803-control cells and the MGC-803-miR-17-92 cells were monitored by a real-time xCELLigence system; B: The protein expression levels of Integrin β1 between the two established cell lines were measured by Western blot; C: The activities of MMP-2 and MMP-9 between the two established cell lines were measured by gelatin zymography experiment.

3 討論

在本研究中， 我們首先通過(guò)qRT-PCR法檢測(cè)了30 例胃癌組織標(biāo)本中miR-17-92基因簇各亞單位的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-17-92基因簇的6個(gè)亞單位（miR-17，miR-18，miR-19a，miR-19b，miR-20及miR-92）在胃癌組織中的表達(dá)量均顯著高于其對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織，且均與胃癌患者的TNM分期呈正相關(guān)，其中miR-17、miR-20的表達(dá)水平還與胃癌患者的腫瘤分化程度呈正相關(guān)，miR-19a、miR-19b、miR-92的表達(dá)水平還與腫瘤大小呈正相關(guān)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與一些已報(bào)道的文獻(xiàn)結(jié)果相一致[13-15]，高度提示miR-17-92基因簇在胃癌發(fā)生發(fā)展中扮演著癌基因樣的角色。

接下來(lái)，我們通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-17-92的MGC-803胃癌細(xì)胞株作為研究模型，來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-17-92對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲能力的影響，并探討其潛在的分子機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-17-92能夠顯著加快MGC-803胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，其機(jī)制與AKT及ERK1/2信號(hào)通路的活化密切相關(guān)。各種細(xì)胞外的信號(hào)刺激都會(huì)誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT信號(hào)通路產(chǎn)生各種應(yīng)答，以促進(jìn)細(xì)胞存活、快速增殖和細(xì)胞生長(zhǎng)。而PTEN作為PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路上游的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子，主要受到miR-17-92基因簇家族成員miR-19的靶向調(diào)控[16]。因此，過(guò)表達(dá)miR-17-92能夠通過(guò)下調(diào)其靶基因PTEN的表達(dá)，進(jìn)而活化PI3K/AKT信號(hào)通路。同樣地，ERK1/2信號(hào)通路也參與細(xì)胞存活、增殖及凋亡抵抗[17]。有研究[18]表明，敲除miR-17能夠顯著抑制KATO-Ⅲ胃癌細(xì)胞的增殖能力，該過(guò)程與ERK1/2的磷酸化水平降低有關(guān)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在MGC-803胃癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-17-92后細(xì)胞內(nèi)AKT及ERK1/2總蛋白的表達(dá)水平并未改變，而AKT蛋白在Thr308位點(diǎn)的磷酸化水平及ERK1/2蛋白的磷酸化水平較對(duì)照組細(xì)胞顯著升高。由此我們可以看出，過(guò)表達(dá)miR-17-92能夠顯著加快MGC-803胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，AKT和ERK1/2信號(hào)通路的活化在其中起著至關(guān)重要的作用。

此外，我們還發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-17-92能夠顯著增強(qiáng)MGC-803胃癌細(xì)胞的侵襲能力。已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，miR-17-92基因簇在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要作用[19]，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其報(bào)道相一致。過(guò)表達(dá)miR-17-92基因簇能夠顯著促進(jìn)DU145前列腺癌細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力[20]。miR-17可以通過(guò)靶向作用ETV1基因調(diào)控其表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的體外遷移能力[21]。miR-19a/b能夠通過(guò)靶向作用c-Myc-MXD1拮抗劑而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲[22]。相反地，有文獻(xiàn)報(bào)道稱miR-17-92基因簇在胃癌中低表達(dá)，且其表達(dá)與轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)[23]。我們的前期研究表明，在MGC-803胃癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-17-92能夠?qū)е翹F-κB信號(hào)通路被激活，而MMP-2作為NF-κB信號(hào)通路的下游靶基因[24]，其表達(dá)活性較對(duì)照組細(xì)胞顯著增強(qiáng)。MMP-2和MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMPs）家族成員，可以降解各種胞外基質(zhì)蛋白，也可以處理多種生物活性分子，參與細(xì)胞增殖、腫瘤細(xì)胞遷移侵襲、細(xì)胞分化、血管生成、細(xì)胞凋亡和宿主防御等生物過(guò)程[25]。近年來(lái)，研究[26]表明miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平參與MMPs調(diào)控，最終影響MMPs基因的翻譯和表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-17-92能夠顯著上調(diào)MMP-2的活性，進(jìn)而增強(qiáng)MGC-803細(xì)胞的侵襲能力。

Integrin β1屬于Integrins家族，由ITGB1基因編碼。Integrins在細(xì)胞表明黏附和識(shí)別作用中起著重要作用，也參與胚胎發(fā)育、止血、組織修復(fù)、免疫應(yīng)答和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散等其他重要的生物學(xué)功能，同時(shí)在腫瘤細(xì)胞的侵襲方面扮演著重要角色[27]。Han等[28]研究表明，在胃癌中Integrin β1作為miR-29c的調(diào)控靶點(diǎn)之一參與并增加腫瘤細(xì)胞的黏附、遷移及侵襲能力。Zhao和Xu等[29-30]還報(bào)道了Integrin β1的表達(dá)情況與胃癌患者的預(yù)后及復(fù)發(fā)密切相關(guān)。另有體內(nèi)實(shí)驗(yàn)[31-32]證實(shí)，胃癌組織中Integrin β1的表達(dá)量與腹膜轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，Integrin β1表達(dá)的沉默可以顯著降低其腹膜轉(zhuǎn)移的發(fā)生率。本研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-17-92能夠顯著上調(diào)MGC-803細(xì)胞中Integrin β1蛋白的表達(dá)，由此可見Integrin β1蛋白表達(dá)上調(diào)可能是miR-17-92增強(qiáng)MGC-803細(xì)胞侵襲能力的潛在機(jī)制之一。

綜上所述，本研究證實(shí)了miR-17-92基因簇在胃癌組織中表達(dá)量較癌旁正常組織顯著升高，且與胃癌患者的腫瘤大小、分化程度及TNM分期呈正相關(guān)。過(guò)表達(dá)miR-17-92能夠顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，該過(guò)程與AKT及ERK1/2信號(hào)通路的激活密切相關(guān)。過(guò)表達(dá)miR-17-92能夠顯著增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的侵襲能力，其機(jī)制與Integrin β1表達(dá)上調(diào)及MMP-2活性增強(qiáng)有關(guān)。這些研究結(jié)果提示了miR-17-92基因簇在胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著癌基因樣的角色，可將其作為胃癌早期診斷的分子生物學(xué)標(biāo)志物，并為探索胃癌分子靶向治療的新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。