尹自飛，高 峰，吳曉峰，周 莉，徐 鋒

（江蘇省昆山市中醫(yī)院，江蘇 昆山 215300）

枸杞在我國已有幾千年的藥用歷史，枸杞中的化學(xué)成分較為復(fù)雜，包括多糖類、生物堿、類胡蘿素、黃酮類、微量元素、氨基酸、維生素等[1]。近年來，大量的實驗藥理學(xué)研究[2]表明，枸杞多糖是枸杞的主要生物活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等多種生物學(xué)作用。枸杞多糖對成骨細(xì)胞MG-63的影響，目前臨床上少有報道，本研究探討枸杞多糖對成骨細(xì)胞MG-63的增殖及凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株：成骨細(xì)胞MG-63購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院資源中心。

1.1.2 主要試劑：MTT，購于Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基，購于Sigma公司；FACSVerse流式細(xì)胞儀，美國BD公司產(chǎn)品；枸杞多糖，寧夏啟元藥業(yè)公司提供（含量50%）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞株培養(yǎng)：MG-63細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱內(nèi)50% CO2、37 ℃培養(yǎng)，2 d換液一次，4～5 d傳代1 次，細(xì)胞生長至瓶底約85%時進行實驗。

1.2.2 實驗分組：①對照組：不加入枸杞多糖。②實驗組：培養(yǎng)基內(nèi)加入枸杞多糖，濃度為10%。

1.2.3 細(xì)胞增殖效應(yīng)：將細(xì)胞以5×104個/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，對照組給予常規(guī)培養(yǎng)3 d，實驗組在對照組基礎(chǔ)上給予10%枸杞多糖培養(yǎng)3 d，并于培養(yǎng)當(dāng)日和培養(yǎng)1、3 d后每孔加10 μL濃度為5 g/L的MTT孵育4 h，每孔加100 μL的DMSO，震蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測490 nm波長吸光度。

1.2.4 細(xì)胞凋亡效應(yīng)：取對照組和實驗組細(xì)胞，用0.25%胰酶消化后制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為每管1×105個細(xì)胞，加入1× 500 Binding Buffer 500 μL，再加入Annexin Ⅴ-FITC 5 μL和PI 10 μL，混勻液體后避光30 min，在1 h 內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 枸杞多糖對成骨細(xì)胞MG-63增殖的影響 與對照組相比，枸杞多糖對MG-63細(xì)胞的增殖具有促進作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 對照組與實驗組細(xì)胞增殖實驗比較（±s）

表1 對照組與實驗組細(xì)胞增殖實驗比較（±s）

組別 n OD值對照組 10 0.73±0.03實驗組 10 0.81±0.04 F-1.02 P 0.03

2.2 枸杞多糖對成骨細(xì)胞MG-63凋亡的影響 與對照組相比，枸杞多糖減少MG-63細(xì)胞的凋亡，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

表2 對照組與實驗組細(xì)胞凋亡實驗比較（±s）

表2 對照組與實驗組細(xì)胞凋亡實驗比較（±s）

項目 對照組（n＝10）實驗組（n＝10） t P G0/G1（%） 50.2±7.8 58.1±6.5 -2.46 0.01 S（%） 17.3±1.3 18.9±0.8 -3.31 0.001 G2/M（%） 30.7±1.8 33.7±2.2 -3.33 0.002細(xì)胞凋亡率（%） 3.9±0.3 3.4±0.5 2.71 0.007

3 討論

大量研究[3]證實，骨骼的正常生長是由成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的細(xì)胞功能共同維持的骨代謝動態(tài)平衡所決定，成骨細(xì)胞是骨形成的主要功能細(xì)胞，其增殖活性是成骨的關(guān)鍵，負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化。破骨細(xì)胞行使骨吸收的功能，與成骨細(xì)胞在功能上相對應(yīng)，二者協(xié)同。當(dāng)骨質(zhì)出現(xiàn)病理性改變時，會使成骨細(xì)胞凋亡增加、破骨細(xì)胞凋亡減少，導(dǎo)致骨形成平衡破壞而使骨化減弱，導(dǎo)致骨微結(jié)構(gòu)損害和骨密度、骨質(zhì)量下降，最終導(dǎo)致骨折的發(fā)生[4]。MG-63成骨細(xì)胞由于其穩(wěn)定的表型可被認(rèn)為是合適的體外細(xì)胞模型。

枸杞多糖具有多種生物活性，是近年來研究的熱點問題[5]。最新的研究[6]證實：枸杞多糖通過抑制Shh信號通路阻滯骨肉瘤HOS細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞增殖并促進細(xì)胞凋亡。張煒等[7]研究證實枸杞多糖對未成熟樹突狀細(xì)胞DC2.4有促進其增殖作用。馬鋒等[8]研究證實枸杞多糖具有促進MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖及礦化作用。黃汀等[9]通過研究證實枸杞多糖對膀胱癌細(xì)胞T-24有抑制其增殖、促進凋亡的作用。本研究通過MTT法證實實驗組在490 nm波長處吸光值高于對照組，枸杞多糖具有促進MG-63成骨細(xì)胞增殖作用，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一次分裂結(jié)束開始生長，到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過程。整個細(xì)胞周期是一個動態(tài)過程，每個分期互相聯(lián)系，不可分割。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞維持生命活動的重要過程，對器官組織的生長發(fā)育、免疫、新陳代謝以及非正常細(xì)胞的清除具有重要意義。閆梅等[10]通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)枸杞多糖對視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡具有抑制作用。本次流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，枸杞多糖具有抑制MG-63成骨細(xì)胞的凋亡作用。

綜上，本實驗證實枸杞多糖能夠促進MG-63成骨細(xì)胞的增殖，抑制其凋亡。為枸杞多糖的進一步臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。