牛子賀，唐浩益，顧 杰，張少卿，王 洋，張立峰，徐志華，陳 彥

（1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部，江蘇 蘇州 215123；2.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科，江蘇 蘇州 215006）

乳腺癌是全世界女性中最常見的惡性腫瘤之一，也是女性中癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[1]。雖然近年來乳腺癌的早期診斷和綜合治療取得一定進(jìn)步[2]，但是乳腺癌患者的預(yù)后并沒有得到明顯改善，再加上某些類型的乳腺癌具有高度侵襲性易發(fā)生轉(zhuǎn)移，其總體生存率仍然很低[3]。因此，研究乳腺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找新的標(biāo)志物，對(duì)乳腺癌患者個(gè)體化治療、延長(zhǎng)生存時(shí)間具有重要意義。纖維蛋白原樣蛋白1（fibrinogen-like protein 1, FGL1）是肝細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞分泌的一種可以促進(jìn)有絲分裂的特異生長(zhǎng)因子，又叫促肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子或者肝細(xì)胞衍生纖維蛋白原相關(guān)蛋白1，可以通過自分泌形式刺激肝細(xì)胞的增殖[4-5]，是Yamamoto等[6]首次從肝細(xì)胞癌標(biāo)本中分離出來的，研究[7]表明，F(xiàn)GL1可以通過激活LAG-3受體參與非小細(xì)胞肺癌的免疫治療。然而在乳腺癌中FGL1相關(guān)研究較少，本研究旨在檢測(cè)FGL1在乳腺癌中的表達(dá)并了解其與預(yù)后的關(guān)系，為臨床治療及預(yù)后預(yù)測(cè)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病人資料收集 收集2020年1月—2021年7月在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院行手術(shù)治療的16 對(duì)乳腺癌患者的癌及癌旁組織標(biāo)本。所有患者手術(shù)之前均未行放化療等輔助治療且術(shù)后病理證實(shí)為乳腺癌。所有患者均簽署知情同意書且經(jīng)蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 免疫組化及結(jié)果判讀 將蠟塊組織切成5 μm厚度切片，烤片2 h后二甲苯脫蠟，酒精脫水，檸檬酸鹽緩沖液中抗原修復(fù)，過氧化氫室溫孵育阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶的活性，10%山羊血清孵育封閉，用PBS沖洗3 遍后，滴加FGL1抗體（美國(guó)加州，博士德，1:1 000），在4 ℃下一抗孵育過夜，PBS沖洗3 遍后室溫條件下二抗孵育1 h，然后與二氨基聯(lián)苯胺（DAB）反應(yīng)，蘇木精復(fù)染分化，二甲苯透明后中性樹膠封片，最后在顯微鏡下觀察染色情況并拍照。免疫組化檢測(cè)結(jié)果由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師評(píng)估，染色強(qiáng)度計(jì)分為0、1、2、3（無、弱、中、強(qiáng)），染色百分比計(jì)分為0、1、2、3（＜5%、5%～25%、26%～50%、51%～100%）。染色強(qiáng)度與染色百分比的乘積作為最終結(jié)果，＞6 分為高表達(dá)組，否則為低表達(dá)組。

1.3 生物信息分析 Kaplan-Meier Plotter是生存數(shù)據(jù)在線分析數(shù)據(jù)庫（http://kmplot.com/analysis/），包含了約54 000 個(gè)基因，21 種癌癥類型，本研究利用該數(shù)據(jù)庫分析乳腺癌患者中FGL1表達(dá)水平與臨床預(yù)后的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，Kaplan-Meier生存曲線分析FGL1表達(dá)水平與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FGL1在乳腺癌組織中表達(dá)降低 通過免疫組化分析FGL1在乳腺癌癌及癌旁組織中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，在16 例乳腺癌患者癌組織標(biāo)本中，低表達(dá)組12 例（75.00%），高表達(dá)組4 例（25.00%）；而在癌旁組織中，高表達(dá)組13 例（81.25%），低表達(dá)組3 例（18.75%），統(tǒng)計(jì)分析表明，與癌旁組織相比，F(xiàn)GL1在乳腺癌癌組織中表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖1，見封二）

2.2 FGL1表達(dá)與乳腺癌患者臨床預(yù)后關(guān)系 利用Kaplan-Meier Plotter在線分析工具我們分析了不同分型下患者的預(yù)后，在StGallen分型中，所有患者中高表達(dá)組無復(fù)發(fā)生存時(shí)間（Relapse Free Survival,RFS）比低表達(dá)組患者更長(zhǎng)（P＝0.00000），有趣的是，在亞組分析中，Basal（P＝0.00047）、Luminal A（P＝0.00049）、Luminal B（P＝0.00073）型乳腺癌中有相同的結(jié)果，而HER2+型乳腺癌中則差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.73）；在PAM50分型中，Basal（P＝0.12）、Luminal A（P＝0.09）、HER2+（P＝0.14）則均差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，僅在Luminal B（P＝0.039）、Normal（P＝0.021）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在Pietenpol分型中，Basal-like 1型乳腺癌中，高表達(dá)組的RFS明顯長(zhǎng)于低表達(dá)組（P＝0.0028），但是在Basal-like 2（P＝0.48）、Immunomodulatory（P＝0.16）、Mesenchymal（P＝0.96）、Mesenchymal stemlike（P＝0.32）、Luminal androgen receptor（P＝0.051）型乳腺癌中則差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果分析表明，F(xiàn)GL1與乳腺癌生存預(yù)后有關(guān)，可以作為預(yù)測(cè)疾病生存的生物學(xué)指標(biāo)。（圖2）

圖2 乳腺癌中FGL1基因表達(dá)對(duì)臨床預(yù)后的影響

3 討論

乳腺癌是多因素、多基因參與的復(fù)雜疾病，目前主要治療手段包括手術(shù)、放化療、內(nèi)分泌及靶向治療在內(nèi)的綜合治療。隨著科技的進(jìn)步，多基因檢測(cè)技術(shù)廣泛開展可以用于評(píng)估患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，在治療、預(yù)后信息等方面提供重要價(jià)值。但是這些基因?qū)τ诨颊呱骖A(yù)后的預(yù)測(cè)體系并不完善，因此我們研究了FGL1基因。

FGL1是纖維蛋白原家族的一員，位于人類8號(hào)染色體（8p21.3-p22），是一個(gè)由二硫鍵連接的同型二聚體組成的68 KD蛋白，可編碼由312 個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，以同源二聚體形式發(fā)揮生物學(xué)活性。目前已知FGL1是肝細(xì)胞再生的產(chǎn)物，參與肝細(xì)胞有絲分裂和肝能量利用。肝切除術(shù)和術(shù)后炎癥釋放的因子白介素6和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β會(huì)影響FGL1的表達(dá)[8]。在這些外源因素誘導(dǎo)下，正常肝細(xì)胞通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT3）和肝細(xì)胞核因子-1A（HNF-1A）調(diào)節(jié)FGL1的轉(zhuǎn)錄[9]。慢性內(nèi)科疾病如高脂血癥、胰島素抵抗、高血糖危象也會(huì)調(diào)節(jié)FGL1的表達(dá)。除上述功能外，血漿中也可以檢測(cè)到FGL1，可以預(yù)測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和登革熱嚴(yán)重程度[10]。綜上，F(xiàn)GL1在良性疾病中發(fā)揮重要作用，是一種潛在的生物標(biāo)記物。當(dāng)然，目前對(duì)FGL1基因表達(dá)調(diào)控研究不局限于生理病理功能探索。FGL1在實(shí)體瘤中的表達(dá)與癌旁組織表達(dá)不同，如Oncomine數(shù)據(jù)集的Meta分析顯示，F(xiàn)GL1在肺癌、前列腺癌、黑色素瘤及結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)，而在胰腺癌、乳腺癌及肝癌中表達(dá)下調(diào)，這與本文中結(jié)果也是一致的。在TCGA數(shù)據(jù)集中，F(xiàn)GL1在肝癌中也是下調(diào)的，研究[11]表明，在肝癌中，由于HNF-1A的缺失，F(xiàn)GL1表達(dá)下調(diào)。此外，F(xiàn)GL1也介導(dǎo)腫瘤EMT過程，但有趣的是FGL1與腫瘤EMT結(jié)論卻不一致，例如，在肝激酶突變的肺腺癌細(xì)胞（A549和H157C）中沉默F(xiàn)GL1，E-cadherin下調(diào)，N-cadherin和Vimentin上調(diào)[12]，但是在SGC-7901胃癌細(xì)胞中，敲除FGL1后出現(xiàn)相反的結(jié)果[13]。因此，關(guān)于FGL1與腫瘤EMT進(jìn)展還有待進(jìn)一步研究。最新研究[7]表明，F(xiàn)GL1和抑制性受體LAG3之間可形成一個(gè)與PD-1/PD-L1不同的免疫抑制途徑，既作用于腫瘤本身，也可作用于免疫細(xì)胞，可通過靶向治療策略對(duì)晚期癌癥產(chǎn)生雙向協(xié)同作用，作為預(yù)測(cè)晚期腫瘤患者抗PD-1/PD-L1治療效果的有效生物標(biāo)志物。

本研究中，我們通過收集乳腺癌及癌旁組織標(biāo)本并進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果提示FGL1在乳腺癌中低表達(dá)，生存分析結(jié)果提示高表達(dá)組較低表達(dá)組的RFS長(zhǎng)，雖然在不同分型中部分亞組分析結(jié)果不一致，但這可能是因?yàn)槠錁颖玖枯^少。因此接下來我們可以收集更多的臨床樣本，對(duì)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制做進(jìn)一步研究。總之，F(xiàn)GL1在乳腺癌中低表達(dá)且與預(yù)后相關(guān)，可有望成為判斷預(yù)后的有效標(biāo)志物。