烏 蘭，湯欣欣，胡孝明，朱華國

(黃岡師范學院 生物與農(nóng)業(yè)資源學院，湖北 黃岡 438000)

光合作用是地球上最重要的生物過程之一，它將無機物轉(zhuǎn)變?yōu)橛袡C物，將光能轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W能?，F(xiàn)有研究表明，植物90%的生物學產(chǎn)量直接來自光合作用產(chǎn)生的有機化合物，如果它們的光合速率提高到滿負荷，則產(chǎn)量將大大增加[1-2]。光合作用提供了幾乎所有生物賴以生存的能量，并調(diào)節(jié)了地球大氣層的組成。植物調(diào)控光合作用的網(wǎng)絡龐大、機理復雜，深入探討其作用機制，對于有效利用太陽能、最大限度的進行光合作用，獲得更多的光合產(chǎn)物具有提綱挈領的意義。本文通過綜述C3植物高光效基因工程育種的研究進展，為油茶高光效基因工程育種提供參考。

1 高光效基因工程育種

1.1 高光效育種簡介

高光效種質(zhì)的發(fā)展始于20世紀60年代[3]，早期研究主要集中在把C3植物改造成C4植物，局限在只要提高光合效率、降低呼吸效率就可以達到增產(chǎn)的目的，雖獲得一些高光效種質(zhì)，但在實際中效果并不理想[4-5]。在進一步的研究中逐步完善了作物高光效育種概念：結合光合生理、生態(tài)和育種目標，利用現(xiàn)代遺傳學和分子生物學研究方法和手段，通過整合形態(tài)結構上的高光效和生理功能上的高光效，提高群體光合效率，促進光合產(chǎn)物向種子中的轉(zhuǎn)化，篩選出光合作用能力顯著加強，產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性同步提高，且符合現(xiàn)代育種目標要求的高光效種質(zhì)資源[6]。

1.2 C3植物高光效基因工程育種

1.2.1Rubisco的改造

地球上生命的生存依賴于光合作用，其中CO2的固定以及隨后的3-磷酸甘油酸酯在卡爾文循環(huán)中的循環(huán)，它們?yōu)榫S持植物的生長發(fā)育提供了必要的碳水化合物基礎。此過程稱為卡爾文循環(huán)，其中的關鍵酶是核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，Rubisco)。在C3植物中，Rubisco主要存在于葉肉細胞的葉綠體間質(zhì)中，在基粒片層上也有少量分布。它每秒僅固定2～5個CO2分子，由于周轉(zhuǎn)速度慢和底物親和力較弱的缺點而成為主要的改良目標[7]。Rubisco催化的效率低下主要源于其雙功能活性，即CO2和O2在活性位點的競爭。固定O2導致光呼吸的浪費，這一過程消耗了固定CO2和光呼吸的ATP總量的30%[7]。隨著Rubisco氧合作用的增加，在水分脅迫、低CO2和高溫的條件下，光呼吸的成本變得更加嚴峻。Rubisco與氧氣催化了一種副反應，導致光呼吸過程中需釋放出先前固定的CO2、NH3和能量。此外，Rubisco催化反應緩慢且需要大量的酶支持才能達到足夠的光合速率[8]。

Rubisco約30億年前在一個二氧化碳含量極高的環(huán)境中演化而成，該環(huán)境中的分子氧很少[9]。 隨著地球大氣層的變化，Rubisco逐漸演變成如今的形式：I型的 Rubisco存在于植物、藻類和藍細菌中，它是一個550 kD的十六聚體，由八個核基因rbcS家族編碼的小亞基(SSU，14-15-kDa)和由葉綠體基因rbcL編碼的八個大亞基(LSUs，52-kDa)組成。SSU前體在進入葉綠體過程中經(jīng)過處理與LSU組裝在一起產(chǎn)生了Rubisco全酶[10]。rbcL基因高度保守，而rbcS較不保守[11]。此外，Rubisco需要重復構象與重塑才能保持活性，還需要多種方法使兩個亞基的結構協(xié)調(diào)一致[8]。如果將Rubisco的催化效率提高5%～25%，則可以在具有充足養(yǎng)分和水供應的適當植物中，在生長季節(jié)提高葉片的光合速率，最終使干物質(zhì)的產(chǎn)量提高數(shù)倍[12-13]。

目前通過基因工程的方法改善Rubisco在葉綠體中的碳同化作用取得了一定的進展。最初發(fā)現(xiàn)Rubisco在紅藻中具有比在高等植物高很多倍的固碳效率[14-15]。在紅藻中發(fā)現(xiàn)的 Rubisco，為其修飾改造提供了可靠依據(jù)。Whitney等通過質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法將紅藻Rubisco的小亞基編碼基因引入煙草的葉綠體中，得到了高效表達，但是表達的小亞基卻不能與煙草本身的大亞基組裝成Rubisco全酶[16]。在水稻中過表達rbcS增加了Rubisco含量，盡管Rubisco含量最多增加30%，但無論在高或低CO2濃度下均未觀察到光合速率的相應提高[17]。這些研究說明了單純提高Rubisco組分大小亞基的表達并不能有效的改善光合效率。之后，在玉米中關于突變體的研究確定了Rubisco組裝和幼苗存活所需的四個伴侶：Cpn60α1(GroEL的同系物)CPS212，Bundle Sheath Defective 2(BSD2)，含有蛋白質(zhì)13的鋅指蛋白和新型蛋白質(zhì)Rubisco Assembly Factor 1 (Raf1)和Rubisco Assembly Factor2(Raf2)[18-19]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Raf1能夠能夠拮抗支架蛋白CcmM介導的Rubisco堆積及相變過程，進而參與調(diào)控Rubisco的堆積和羧酶體內(nèi)核的形成[20]。在C3植物中參與Rubisco生物發(fā)生的新Rubisco裝配因子的發(fā)現(xiàn)，為在高等植物中修飾與改造Rubisco提供了新的步驟，為光合速率的改善帶來了新的突破口。

因此，要提高Rubisco的固碳能力需要進一步了解該酶的蛋白結構與其催化效率之間的關系，還有其大小亞基組裝成全酶的修飾機制。直接提高Rubisco本身的催化潛力至關重要，但間接改善植物體內(nèi)Rubisco也同樣關鍵[21]。這些措施包括提高Rubisco輔助蛋白、Rubisco活化酶的耐熱性，以及對抑制Rubisco活性的物質(zhì)進行調(diào)節(jié)等。在C3模型植物物種(煙草等)和農(nóng)作物物種(水稻，小麥等)相關研究已經(jīng)開始進行。例如通過增加景天庚酮糖1,6-二磷酸酯酶(sedoheptuloseose-1,7-bisphosphatase，SBPase)活性來增強卡爾文循環(huán)中RuBP的再生[22]、增加Rubisco活化酶的耐熱性以及在中等溫度下維持Rubisco活性[23]。利用CRISPR/Cas9敲除水稻Rubisco的小亞基rbcS，并轉(zhuǎn)入高粱的rbcS基因而獲得的轉(zhuǎn)基因水稻表達出類似C4植物的催化特性[24]。在煙草中發(fā)現(xiàn)同時刺激電子傳輸和RuBP再生會導致碳同化顯著增加，并致使溫室和田間條件下生物量和產(chǎn)量的增加。在田間條件下可將植物生產(chǎn)力提高27%，同時還可以有效減少植物的用水量[25]。

近年來，植物高光效育種中對Rubisco的研究逐漸成為熱點，不斷在細胞層面和分子層面解析Rubisco的復雜機制，正在研究通過酶工程或提高葉綠體中CO2的方法來改善Rubisco催化效率低下的問題，目前尚未闡明Rubisco的組裝機制，其活化酶Rca的功能也尚未解析。未來對于Rubisco的進一步研究將有助于我們改變植物尤其是C3植物光合作用中的有機物積累和碳同化作用，為提高生物產(chǎn)量帶來新的可能。

1.2.2C3植物中引入C4途徑

前人研究發(fā)現(xiàn)參與C4途徑的光合酶也存在于一些C3植物中，但活性較低[31-33]。在典型的C3植物煙草中，木質(zhì)部和韌皮部周圍莖和葉柄的細胞中存在PEPC，NADP-ME和PPDK的表達[34]。在小麥中C4特異性光合基因在小麥穎果的果皮組織中表達[35]。在大豆的葉片中檢測到四種與C4途徑相關的酶的活性[36]。與C4光合作用相關的許多基因(例如NADME，PEPC，PPDK和NADP-ME)已成功轉(zhuǎn)如C3植物的基因組中[30，37]。將高粱的NADP-ME基因引入水稻‘Nongken’58中，從而使NADP-ME活性提高了1～7倍，并在高光強度下增加了光抑制作用[38]。前人將玉米(ZeamaysL.)的PEPC基因轉(zhuǎn)到水稻基因組中，引起水稻葉片中氣孔的密度和面積增加以及干物質(zhì)的積累增多[39]。在燕麥(AvenasativaLinn.)中過表達編碼玉米PEPC轉(zhuǎn)運蛋白的基因時，其葉片觀察到較大的束鞘細胞，細胞壁脂質(zhì)沉積增加的現(xiàn)象[40]。在C3植物中引入C4途徑具有成功的實例，說明了這一方法的具有一定的可行性，因為要進行植物的同源轉(zhuǎn)化，對于植物本身的技術研究水平還有一定的要求，并不適用于全部的C3植物，這一方法具有一定的局限性。關于大莎草(EleocharisviviparaLink)C4光合作用代謝通路最近鑒定出了包括5個轉(zhuǎn)錄因子、4個受體樣蛋白和1個BURP蛋白共10個調(diào)節(jié)基因[41]，為其他物種的高光效育種提供了切實的理論依據(jù)。Chen[42]等研究發(fā)現(xiàn)了C3-C4和C4光合作用之間的主要轉(zhuǎn)錄差異，這將為反向遺傳學在高光效育種中研究提供潛在目標。

1.2.3其他途徑

隨著科研水平的不斷提高，在高光效基因工程育種的途徑中不斷出現(xiàn)新技術和新觀點。例如，人造葉綠體的成功構建帶來了人工光合作用領域的里程碑式的進展：研究人員利用微流體體系模擬植物的葉綠體，即利用菠菜的類囊體薄膜實現(xiàn)光反應，并驅(qū)動合成酶循環(huán)過程，在細胞尺寸的油包水液滴中實現(xiàn)了CO2固定和光合成反應[43]。South[44]等人使用合成生物學的方法，重新設計光呼吸過程，使轉(zhuǎn)基因煙草的植株生長量較野生型煙草提高了40%。利用多基因組裝和轉(zhuǎn)化系統(tǒng)在水稻葉綠體中成功建立了新的光呼吸旁路，通過遺傳工程手段在擬南芥、煙草和水稻中創(chuàng)建的由高溫響應啟動子驅(qū)動的細胞核融合基因表達的D1蛋白合成途徑，建立了植物細胞D1蛋白合成的“雙途徑”機制(天然的葉綠體途徑和創(chuàng)建的核途徑)。通過新增的細胞核源D1合成途徑顯著提高了擬南芥、煙草和水稻的高溫抗性、光合作用效率、二氧化碳同化速率和生物量[45]，為水稻增產(chǎn)提供了新方式，也為其他物種的高光效育種提供了新思路。

2 油茶高光效基因工程育種進展及展望

油茶(CamelliaoleiferaAbel.)屬山茶科(Theaceae)山茶屬(CamelliaL.)植物，是我國特有的木本食用油料樹種，與油橄欖、 油棕、椰子并稱為世界四大木本油料植物[46]，起源于中國并在南方18個省市均有分布[47]。目前，我國約有油茶種植面積300萬公頃，每年生產(chǎn)約26萬噸山茶油[48]。從油茶種子中提取的茶油是一種高質(zhì)量的食用油，茶油富含多種植物化學物質(zhì)[46]，含有90%左右的不飽和脂肪酸，其中單不飽和脂肪酸超過80%[49]。前人研究顯示，食用茶油有益于健康，有助于降低血脂和預防心血管疾病[50]、減輕乙醇對胃粘膜的損害[51]，減少體內(nèi)脂肪積累和預防肝脂肪變性的功效[52]。油茶花芽發(fā)育周期長，從5月上旬花芽分化開始至10月中下旬開花，歷時5個多月[53]，次年3月到10月為果實生長期[54]。由此可以看出油茶從花芽分化到果實完全成熟共用18個月之久，花果共存的現(xiàn)象體現(xiàn)了油茶“抱子懷胎”的特性，表明油茶開花結實耗時長，對于營養(yǎng)物質(zhì)的需求量是極其巨大的。

前人研究發(fā)現(xiàn)，油茶光合特性表現(xiàn)為CO2飽和點較低、補償點較高, 光合效率不高等特點[55]，其凈光合速率日變化規(guī)律存在一致性，即均為“雙峰”曲線，存在明顯的“光合午休”現(xiàn)象[56]，這些都佐證了油茶屬于C3植物這一結論。中國對茶油的需求在不斷增長，尤其對其產(chǎn)量和品質(zhì)追求日益提升[57]。目前，C3植物的高光效基因工程育種工作的策略主要集中于操控光合反應過程，為了最小化光吸收期間的能量損失和加速碳固定而進行的對于Rubisco的改造，引入C4途徑和人工開發(fā)新的合成途徑這三大類。油茶高光效基因工程育種相關研究較少。關于油茶Rubisco的研究，僅分離獲得了Rubisco亞基rbcL(1,522 bp)和rbcS(1,425 bp)的全長cDNA，研究表明Co-rbcL的表達水平與種子產(chǎn)量和油脂產(chǎn)量高度相關(P<0.001)，Co-rbcS的表達與產(chǎn)量相關(P<0.01)，Co-rbcS和Co-rbcL可能是早期選擇高油產(chǎn)量品種的分子標記[58]。

油茶的遺傳轉(zhuǎn)化困難，本文綜述其他物種高光效基因工程育種的成功實例，為選擇油茶高光效相關基因應用于油茶高光效基因工程育種指明了方向。