向 福，艾勇泉，徐俊偉，余時(shí)敏，方元平

(1.經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃岡 438000；2. 黃岡師范學(xué)院 李時(shí)珍大健康研究院，湖北 黃岡 438000；3. 湖北省中科產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，湖北 黃岡 438000)

抗氧化是指抗氧化自由基的簡(jiǎn)稱(chēng)。人體在與外界接觸時(shí)，受自身的呼吸(氧化)和外界環(huán)境因素的影響，體內(nèi)會(huì)不斷地產(chǎn)生自由基[1]。一般來(lái)說(shuō)，人體內(nèi)自由基數(shù)目處于動(dòng)態(tài)的消長(zhǎng)平衡過(guò)程，對(duì)人體不會(huì)造成傷害，但平衡被打破時(shí)，大量的自由基就會(huì)氧化損傷機(jī)體細(xì)胞，從而引發(fā)各種疾病[2]，動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癌癥及衰老過(guò)程等疾病的發(fā)生與自由基密切相關(guān)[3]。

中藥作為一種天然的抗氧化劑應(yīng)用廣泛，大量研究表明，中藥有效成分可以通過(guò)調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體特異性及非特異性免疫功能，能抑制自由基的產(chǎn)生或直接作用于自由基對(duì)細(xì)胞及組織的損傷部位[4]。但中藥成分復(fù)雜，目前關(guān)于中藥的藥理研究主要集中于藥效評(píng)價(jià)，對(duì)于其作用機(jī)制的深入研究仍較少[5]。

黃岡大別山地區(qū)特色植物資源豐富，中藥材種植面積達(dá)110萬(wàn)畝。葛根、靈芝和當(dāng)歸均為大別山地區(qū)主要藥物植物，其中葛根含有葛根異黃酮、葛根素等活性成分，二者均具有較強(qiáng)的抗缺氧和抗氧化作用[6]；靈芝含有多糖、三萜酸類(lèi)和生物堿等多種物質(zhì)，具有多種生物活性、毒性小，是理想的抗氧化劑[7]；當(dāng)歸含有多糖、揮發(fā)油等活性成分，也具有一定的抗氧化活性[8]。但三味中藥在抗氧化作用機(jī)制方面研究較少，因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，揭示葛根-靈芝-當(dāng)歸復(fù)方抗氧化作用機(jī)制，以期為深入研究抗氧化藥理作用機(jī)制，為大別山地區(qū)葛根、靈芝、當(dāng)歸等特色藥材資源利用和臨床應(yīng)用提供證據(jù)和方向。

1 材料與方法

1.1 葛根-靈芝-當(dāng)歸主要活性成分篩選

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理分析平臺(tái)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)[9]，以口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%，類(lèi)藥性(Drug-Likeness，DL)≥0.18為篩選條件，檢索葛根-靈芝-當(dāng)歸中的三味中藥活性成分。

1.2 活性成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)篩選

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，并結(jié)合UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因名，規(guī)范靶點(diǎn)蛋白[10]。利用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)以“anti-oxidant”為關(guān)鍵詞檢索，獲取抗氧化的相關(guān)靶點(diǎn)，與葛根-靈芝-當(dāng)歸活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)取交集，獲得葛根-靈芝-當(dāng)歸干預(yù)抗氧化的潛在靶點(diǎn)。

1.3 構(gòu)建葛根-靈芝-當(dāng)歸活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape軟件構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)各個(gè)節(jié)點(diǎn)的中心度值(Degree)、介度(Betweeness Centrality)等數(shù)據(jù)，分析活性成分和靶點(diǎn)。

1.4 構(gòu)建葛根-靈芝-當(dāng)歸PPI網(wǎng)絡(luò)圖和頻次分布圖

將干預(yù)抗氧化的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，物種選擇“Homo sapiens”，設(shè)置蛋白互作綜合得分>0.7，其余參數(shù)不變，隱藏游離靶點(diǎn)，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖，下載其TSV文件格式，導(dǎo)入Cytoscpe繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，對(duì)超過(guò)平均度值的靶蛋白進(jìn)行頻次分析。

1.5 潛在靶點(diǎn)的GO功能及KEGG通路富集分析

將葛根-靈芝-當(dāng)歸干預(yù)抗氧化的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，得到生物過(guò)程、細(xì)胞成分、分子功能和KEGG通路數(shù)據(jù)[11-12]，以P<0.05為篩選條件，選取排名前20的條目繪制圖形進(jìn)行可視化分析。

1.6 分子對(duì)接

選擇1.3中突出的前5種活性成分作為小分子，進(jìn)行加氫、加電荷處理，選擇1.3和1.4交互的核心靶點(diǎn)作為靶點(diǎn)蛋白，從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載靶點(diǎn)文件。利用Autodock軟件對(duì)蛋白進(jìn)行去水、加氫、加電荷處理，并進(jìn)行小分子與蛋白對(duì)接處理，獲取對(duì)接能量，通過(guò)PyMOL軟件進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 葛根-靈芝-當(dāng)歸主要活性成分篩選

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為篩選條件，共尋找到67種活性成分：靈芝61種(靈芝活性成分過(guò)多，只列出突出的4種成分)、葛根4種及當(dāng)歸2種活性成分(表1)。葛根中葛根素(puerarin)的OB值雖小于30%，但DL值為0.69，且其功效突出，故將其計(jì)入其中，所以共計(jì)68種活性成分，有效成分β-谷甾醇(β-sitosterol)為三種中藥共有活性成分，故考慮此活性成分為葛根-靈芝-當(dāng)歸復(fù)方干預(yù)抗氧化的主要活性成分。

表1 葛根-靈芝-當(dāng)歸復(fù)方部分活性成分表

2.2 葛根-靈芝-當(dāng)歸和抗氧化靶點(diǎn)篩選

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)葛根-靈芝-當(dāng)歸68種活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，刪除重復(fù)值共得到109個(gè)靶點(diǎn)，并結(jié)合UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因名，規(guī)范靶點(diǎn)蛋白。

通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)以“anti-oxidation”為關(guān)鍵詞對(duì)其檢索，共得到982個(gè)靶點(diǎn)，根據(jù)藥物活性成分靶點(diǎn)和抗氧化靶點(diǎn)，繪制韋恩圖，共得到56個(gè)重復(fù)靶點(diǎn)，即為葛根-靈芝-當(dāng)歸干預(yù)抗氧化的潛在靶點(diǎn)(圖1)。

圖1 葛根-靈芝-當(dāng)歸和抗氧化靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

將葛根-靈芝-當(dāng)歸篩選得到的主要活性成分和潛在干預(yù)抗氧化的靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件建立成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(圖2)，其中“KYH”表示葛根-靈芝-當(dāng)歸干預(yù)抗氧化的潛在靶點(diǎn)，“FF”表示葛根-靈芝-當(dāng)歸復(fù)方活性成分。度值表示預(yù)測(cè)出該成分與作用靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)個(gè)數(shù)，成分度值越大說(shuō)明該成分越重要。在與潛在靶點(diǎn)相互作用的活性成分中，Degree大于平均值的活性成分有5種，分別是β-谷甾醇、葛根素、刺芒柄花素(formononetin)、3'-甲氧基大豆黃素(3'-methoxydaidzein)、豆甾醇(stigmasterol)，Degree大于平均值的靶點(diǎn)有PTGS2、PTGS1、JUN、BCL2、CASP8、PPARG等。從圖2可知，一個(gè)成分對(duì)應(yīng)多個(gè)靶點(diǎn)，同時(shí)多個(gè)成分也對(duì)應(yīng)著一個(gè)靶點(diǎn)，表明葛根-靈芝-當(dāng)歸是多成分、多靶點(diǎn)共同干預(yù)抗氧化。

圖2 葛根-靈芝-當(dāng)歸活性成分和干預(yù)抗氧化潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 葛根-靈芝-當(dāng)歸PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將葛根-靈芝-當(dāng)歸和抗氧化共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)果信息導(dǎo)入Cytoscpe進(jìn)行分析，共得到52個(gè)節(jié)點(diǎn)(去除4個(gè)游離的節(jié)點(diǎn))，227條邊，如圖3所示。節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深，表明對(duì)其靶點(diǎn)調(diào)控的活性成分越多。由圖2中Degree≥8的AKT1、STAT3、JUN、TNF、VEGFA、PTGS2等19個(gè)靶點(diǎn)，繪制圖4所示頻次分布圖，其中圖3涉及的靶點(diǎn)包含成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中主要靶點(diǎn)，兩圖的主要靶點(diǎn)相互關(guān)聯(lián)，推測(cè)葛根-靈芝-當(dāng)歸可能通過(guò)JUN、CASP8、PPARG、CASP3、PTGS2等靶點(diǎn)作用于抗氧化。

圖3 葛根-靈芝-當(dāng)歸干預(yù)抗氧化的潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 葛根-靈芝-當(dāng)歸與抗氧化共同靶點(diǎn)頻次分布

2.5 潛在靶點(diǎn)的GO功能和KEGG富集分析

將葛根-靈芝-當(dāng)歸干預(yù)抗氧化的潛在56個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入David數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行GO(Gene ontology)分析和KEGG(KEGG pathway analysis)代謝通路富集分析。GO分析結(jié)果(圖5)顯示，生物過(guò)程中主要包括對(duì)藥物的反應(yīng)(response to drug)、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控(negative regulation of apoptotic process)、老化(aging)等；由細(xì)胞成分可推測(cè)這些靶點(diǎn)主要集中在胞質(zhì)溶膠(cytosol)、細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)、核質(zhì)(nucleoplasm)等；分子功能主要集中于相同的蛋白質(zhì)結(jié)合(identical protein binding)、酶結(jié)合(enzyme binding)、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(transcription factor binding)等。KEGG通路分析結(jié)果表明，主要通路集中于癌癥的途徑(Pathways in cancer)、TNF信號(hào)通路(TNF signaling pathway)、細(xì)胞凋亡(Apoptosis)等(圖6)。因此，葛根-靈芝-當(dāng)歸可能通過(guò)老化、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、抗缺氧的反應(yīng)等方式對(duì)氧化起著抑制作用，從而干預(yù)抗氧化。

圖5 靶點(diǎn)的GO富集分析：生物過(guò)程，細(xì)胞成分，分子功能

圖6 靶點(diǎn)的 KEGG 富集分析圖

2.6 分子對(duì)接分析

為了驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)葛根-靈芝-當(dāng)歸三味中藥活性成分抗氧化作用靶點(diǎn)的可靠性，采用分子對(duì)接方法從理論上對(duì)與排名靠前的靶點(diǎn)的結(jié)合能力進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)表2，三味中藥部分活性成分可與JUN、CASP3、CASP8、PPARG靶點(diǎn)發(fā)生結(jié)合，其結(jié)合自由能均小于0 kJ/mol，表明突出成分與上述靶點(diǎn)具有較強(qiáng)的結(jié)合力，且三味中藥突出成分β-谷甾醇、刺芒柄花素、3'-甲氧基大豆黃素、豆甾醇與靶點(diǎn)間的結(jié)合能均存在小于-5 kJ/mol的情況，表明突出活性成分和核心靶點(diǎn)間有較大的結(jié)合能力，葛根-靈芝-當(dāng)歸復(fù)方部分活性成分與靶點(diǎn)的分子對(duì)接復(fù)合體可視化結(jié)果見(jiàn)圖7。

表2 葛根-靈芝-當(dāng)歸部分活性成分與突出靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果

圖7 葛根-靈芝-當(dāng)歸部分活性成分與靶點(diǎn)的分子對(duì)接復(fù)合體

3 討論

《素問(wèn)百·至真要大論》記載“君一臣二，度制之小也”?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》所記載上、中、下三品之藥，分別為君、臣與佐使，功能各有不同[13]。葛根，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為中品，葛根含有葛根異黃酮成分、葛根素等活性成分，研究表明，二者均具有較強(qiáng)的抗缺氧和抗氧化作用[6]。靈芝，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品，含有多糖、三萜酸類(lèi)和生物堿類(lèi)等多種物質(zhì)具有多種生物活性，毒性小，是理想的抗氧化劑[7]。當(dāng)歸，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為中品，發(fā)現(xiàn)其含有多糖、揮發(fā)油等活性成分，也具有一定的抗氧化活性[8]。以靈芝為君藥，葛根和當(dāng)歸為臣藥組成的一君二臣復(fù)方是一種小劑量復(fù)方，在抗氧化方面具有一定作用。

3.1 多成分-多靶點(diǎn)干預(yù)抗氧化

葛根-靈芝-當(dāng)歸可能通過(guò)調(diào)控JUN、CASP3、CASP8、PPARG等靶點(diǎn)抑制抗氧化。其中JUN是組成轉(zhuǎn)錄因子AP-1的重要亞基，可以負(fù)調(diào)控TP53的表達(dá)，從而參與調(diào)控機(jī)體氧化還原反應(yīng)[18]。PPARG可直接調(diào)控與氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)，以應(yīng)對(duì)機(jī)體氧化應(yīng)激損傷，既可促進(jìn)抗氧化基因表達(dá)，也可抑制促氧化基因表達(dá)[19]。CASP3和CASP8在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起重要作用，其中CASP3當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，其主要表現(xiàn)為線(xiàn)粒體膜損傷，線(xiàn)粒體內(nèi)的細(xì)胞色素釋放到細(xì)胞外，激活CASP3從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而延緩衰老[20]。

3.2 多通路干預(yù)抗氧化

葛根-靈芝-當(dāng)歸和抗氧化的56個(gè)潛在靶點(diǎn)在“Pathways in cancer”、“TNF signaling pathway”和“Apoptosis”通路富集程度較高，三者涉及的共同靶點(diǎn)為CASP3、AKT1、FOS、PIK3CG。CASP3可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而延緩衰老[20]，AKT1參與包括細(xì)胞凋亡和葡萄糖代謝在內(nèi)的細(xì)胞過(guò)程，是參與氧化應(yīng)激的主要激酶[21]。FOS和PIK3CG等基因也多在由自由基引起的動(dòng)脈粥樣硬化和癌癥等疾病中表達(dá)，參與疾病的調(diào)控。因此當(dāng)機(jī)體發(fā)生氧化作用時(shí)，可能通過(guò)以上通路中的靶點(diǎn)作用來(lái)干預(yù)抗氧化。

綜上所述，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)發(fā)現(xiàn)，葛根-靈芝-當(dāng)歸能通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用模式來(lái)干預(yù)抗氧化。但是，中藥復(fù)方的使用并不是各味中藥有效成分簡(jiǎn)單的疊加，且目前對(duì)于中藥活性成分的研究仍存在不足，使得該類(lèi)技術(shù)仍存在一定的局限性。