陳 莎,劉 濤,王 帥,王艷陽,徐 帥,潘偉儀,李 利

(長江大學生命科學學院,湖北荊州 434025)

紅曲色素(Monascuspigments,MPs)是絲狀真菌紅曲菌(Monascusspp.)產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物,在我國用于食品著色已經(jīng)有兩千多年的歷史[1]。根據(jù)我國食品安全國家標準《食品添加劑使用標準》(GB 2760-2014),紅曲色素可用于腌臘肉制品、熟肉制品、調制乳、果醬、糖果、糕點等28個類別的食品中,且大部分沒有限定最大使用量。隨著一些合成食用色素毒性的不斷被發(fā)現(xiàn),健康、安全的天然食用色素越來越受到青睞[2]。紅曲色素作為一種天然微生物色素,不僅具有安全性好、產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低、色調豐富(從黃到紅)、溶解性好等優(yōu)點,還被證實具有抗炎、抗氧化、免疫調節(jié)、抗腫瘤、降血糖和降血脂等多種生物活性[3-6],因此需求量逐年增大,目前我國紅曲色素年產(chǎn)量超過2萬噸[7]。

紅曲色素有6種主要色素組分,分別為2種黃色素:紅曲素(monascin)和安卡紅曲黃素(ankaflavin);2種橙色素:紅斑紅曲素(rubropunctatin)和紅曲玉紅素(monascorubrin);2種紅色素:紅斑紅曲胺(rubropunctamine)和紅斑玉紅胺(monascorubramine)[7]。每類色素的2種組分有著相似的結構,差異在于烷基支鏈的長度(圖1),其中紅曲素、紅斑紅曲素和紅斑紅曲胺的烷基支鏈為C5H11,而安卡紅曲黃素、紅曲玉紅素和紅斑玉紅胺為C7H15。目前,還沒有一種發(fā)酵技術可以生產(chǎn)單一的紅曲色素組分,不同紅曲色素組分通常以混合物形式存在于發(fā)酵產(chǎn)物中[8]。由于分離制備難度大、成本高,紅曲色素也通常以混合物形式應用于食品工業(yè),雖然其色調根據(jù)不同顏色色素組分的含量而有所差異,但一般均以紅色組分為主[9]。

圖1 六種主要紅曲色素組分的化學結構Fig.1 Chemical structures of six major Monascus pigment components

天然色素一般為高度不飽和的化合物,易受光、熱、氧、酸堿等因素的影響而發(fā)生顏色變化[10]。紅曲色素是一類由紅、黃、橙三種顏色色素組成的混合物,其中任何一種色素的變化都會對產(chǎn)品產(chǎn)生影響,因此了解不同色素組分的穩(wěn)定性差異,對紅曲色素產(chǎn)品的應用具有重要的指導意義。然而,紅曲色素的穩(wěn)定性研究目前主要集中于色素混合物以及紅色素組分[11-16],黃色素和橙色素組分的相關報道還較少[17-18]。本研究通過大孔樹脂柱層析分離得到紅曲黃色素和橙色素組分,從pH、光照和溫度三個方面評估了其穩(wěn)定性,以期為高穩(wěn)定性紅曲色素產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅色紅曲菌M7(MonascusruberM7,CCAM 070120) 中國典型培養(yǎng)物保藏中心,用于紅曲色素的發(fā)酵與制備;大孔樹脂CAD-40 鄭州和成新材料科技有限公司;姜黃色素 食品級,鄭州嘉源食品配料有限公司;鹽酸、氫氧化鈉、葡萄糖、氯化鈉、檸檬酸、磷酸氫二鈉、乙醇、甲酸、無水乙醇 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;乙腈 色譜純,美國天地有限公司。

UV-1900紫外-可見分光光度計 北京普析;Beckman Allegra X-30R離心機 德國貝克曼;LC1200高效液相色譜儀 美國安捷倫;UltiMate 3000-TSQ Altis液相色譜-質譜聯(lián)用儀 美國熱電;KQ-600DE超聲波提取器 昆山舒美;BS-100A組分收集器 上海青浦;PB-10pH計 德國賽多利斯;IS-RDS3恒溫搖床 美國精騏;HH-4水浴鍋 浙江金壇杰瑞爾。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅曲色素的發(fā)酵與制備 以1%的接種量將紅曲菌孢子液(105個/mL)接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)中,28 ℃,200 r/min恒溫振蕩條件培養(yǎng)40 h;然后向發(fā)酵液中加入等體積的無菌的0.2 mol/L pH6檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液,28 ℃,200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)5 d。發(fā)酵完畢后,發(fā)酵液經(jīng)300目濾布抽真空過濾,收集菌絲體。用2倍發(fā)酵液體積的酸水(pH2,甲酸調節(jié))沖洗菌絲,用吸水紙壓干水分,加入與發(fā)酵液體積相等的70%的乙醇溶液(用無水乙醇和pH=2的甲酸水溶液配制),于30 ℃條件下超聲波(100 W)輔助提取2 h,8000 r/min離心10 min,上清液即為紅曲色素粗提液。

1.2.2 大孔樹脂CAD-40的預處理 參照Zhang等[19]的方法,具體如下:95%(v/v)乙醇浸泡24 h,使大孔樹脂充分溶脹,用去離子水沖洗到不出現(xiàn)白色渾濁液和沒有乙醇味為止,再加入5% HCl(v/v)溶液浸泡4 h,用去離子水沖洗至中性,然后用5% NaOH(m/v)溶液浸泡4 h,用去離子水沖洗至中性,得到預處理好的大孔樹脂。

1.2.3 色素的分離純化 采用濕法裝柱,將預處理后的大孔樹脂CAD-40裝填于玻璃層析柱中(25 cm×1 cm ID),柱床高度23 cm,柱床體積18 mL。50 mL色素粗提液(5.0±0.2 U/mL,以470 nm計)上樣,上樣速率3.0 BV/h。吸附平衡后,用4 BV無水乙醇以1 BV/h速率洗脫,收集第0.94～1.22 BV洗脫液為F1(主要含紅曲黃色素),收集第2.22～4 BV洗脫液為F2(主要含紅曲橙色素)。

1.2.4 紅曲色素的分析 紅曲色素的紫外-可見光譜分析、HPLC分析和LC-MS分析參考Li等[20]的方法。具體如下:

1.2.4.1 紫外-可見光譜分析 在300～600 nm范圍內進行掃描,紅曲黃色素和橙色素的色價分別以400和470 nm的吸光值計算。色價(U/mL)=吸光值A×稀釋倍數(shù);色素殘留率(%)=處理后的色價/處理前的色價×100。

1.2.4.2 HPLC分析 色譜柱:Inertsil ODS-3(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫:30 ℃;流動相:A相為乙腈,B相為酸水(pH=3,甲酸調),C相為純水,梯度洗脫條件見表1;流速:0.8 mL/min;進樣量:20 μL;檢測器:二極管陣列檢測器(DAD);檢測波長:210～600 nm,其中紅曲黃色素、橙色素和紅色素組分的監(jiān)測波長分別為380、470和520 nm。紅曲黃色素組分的含量以380 nm下的峰面積計算,橙色素組分的含量以470 nm下的峰面積計算。

表1 HPLC的梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions of HPLC

1.2.4.3 LC/MS分析 色譜柱:Thermo Hypersil GOLD C18(100 mm×2.1 mm,3 μm);柱溫:40 ℃;流動相:A相為乙腈,B相為酸水(pH=3,甲酸調);梯度洗脫條件:0～3 min,35% A;3～18 min,35% A～70% A;18～23 min,70% A～90% A;23～24 min,90% A～35% A;24～27 min,35% A;流速:0.3 mL/min;進樣量:10 μL;DAD檢測波長:210～600 nm;離子源:電噴霧電離(ESI),正離子模式;掃描范圍:m/z 200～600;電噴霧電壓:3500 V;離子傳輸管溫度:350 ℃;脫溶劑溫度:400 ℃;鞘氣壓力30 arb;輔助氣壓力5 arb。根據(jù)質譜檢測到的準分子離子[M+H]+峰確定各紅曲色素組分的分子量,并與目前報道的100多種紅曲色素[7]的分子量進行比對,以進行定性分析。

1.2.5 pH穩(wěn)定性試驗 配制0.1 mol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH2、pH3、pH4、pH5、pH6、pH7),0.1 mol/L磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(pH8)和0.1 mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液(pH9)。色素溶液(2.0±0.2 U/mL)分別與8個不同pH的緩沖液以3∶7的比例混合,25 ℃放置24 h后進行色素分析。所有實驗組設置三個平行。

1.2.6 光穩(wěn)定性試驗 將2.0±0.2 U/mL的色素溶液置于石英比色皿(光程為1 cm),密封,放入安裝有紫外燈(254 nm,8 W)的暗盒子,使紫外光垂直透過石英比色皿的透光面,照射距離為8 cm,照射時間270 min,照射期間取樣進行色素分析。對照采用(2.0±0.2) U/mL的姜黃色素溶液(色價以最大吸收波長424 nm計算)。所有實驗組設置三個平行。

1.2.7 熱穩(wěn)定性試驗 將(1.0±0.1) U/mL的色素溶液置于帶聚四氟乙烯襯墊螺旋蓋的厚壁耐壓管,分別放置在60和80 ℃下避光處理120 min,處理期間取樣進行色素分析。對照采用(1.0±0.1) U/mL的姜黃色素溶液(色價以最大吸收波長424 nm計算)。所有實驗組設置三個平行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007和Origin 7.5進行數(shù)據(jù)處理及作圖。

2 結果與分析

2.1 紅曲黃色素和紅曲橙色素的分離制備

紅曲色素粗提物經(jīng)CAD-40大孔樹脂柱層析分離后,共收集到2個洗脫組分F1和F2。由圖2可知,F1在400 nm附近有最大吸收峰,表明主要為黃色素組分;F2在470 nm附近有最大吸收峰,表明主要為橙色素組分(圖2a和2b)。經(jīng)HPLC和LC-MS分析發(fā)現(xiàn),F1主要含2個黃色素物質Y1和Y2(圖2c),二者百分含量之和達79.8%±3.3%(以HPLC峰面積計),準分子離子[M+H]+峰分別為m/z 359.14 和m/z 387.20,分別與2種主要紅曲黃色素組分紅曲素(C21H26O5)和安卡紅曲黃素(C23H30O5)的分子量一致。F2主要含2個橙色素物質O1和O2(圖2d),二者百分含量之和達91.3%±1.3%(以HPLC峰面積計),準分子離子[M+H]+峰分別為m/z 355.15和m/z 383.12,與2種主要紅曲橙色素組分紅斑紅曲素(C21H22O5)和紅曲玉紅素(C23H26O5)的分子量一致。后續(xù)實驗中,均以該紅曲黃色素F1和紅曲橙色素F2為材料進行穩(wěn)定性研究。

圖2 洗脫組分F1和F2的紫外-可見吸收光譜圖及HPLC色譜圖Fig.2 UV-Vis spectra and HPLC chromatograms of fractions F1 and F2注:HPLC分析時,分別于380、470和520 nm下監(jiān)測紅曲黃色素、橙色素和紅色素。圖4同。

2.2 pH穩(wěn)定性分析

由圖3a、3b可知,在pH2～4范圍內,紅曲黃色素F1和紅曲橙色素F2的顏色和紫外-可見吸收光譜均無明顯變化;在pH5～9范圍內,紅曲黃色素F1和紅曲橙色素F2的顏色較pH2～4時明顯偏紅,紫外-可見吸收光譜也均在520 nm附近出現(xiàn)吸收峰,不同的是,紅曲黃色素F1在400 nm處的特征吸收峰保持不變,且對應的吸收強度未有明顯變化,而紅曲橙色素F2在470 nm處的特征吸收峰消失,但在410和520 nm附近分別出現(xiàn)一個新的吸收峰。

圖3 不同pH下紅曲黃色素F1和紅曲橙色素F2的穩(wěn)定性Fig.3 Stability of the yellow fraction F1 and orange fraction F2 at different pH

關于紅曲橙色素的pH敏感性,石侃[21]也報道了相似的實驗現(xiàn)象,并推測pH升高促使了橙色素的內酯鍵斷裂以及生色團上共軛雙鍵發(fā)生了重排,使其光譜出現(xiàn)了明顯的紅移。另外,研究發(fā)現(xiàn),高pH環(huán)境(特別是pH≥6)有助于促使紅曲橙色素發(fā)生親氨反應生成紅曲紅色素[22-23],而食品基質中通常含有豐富的氨基酸等含-NH2的化合物,若不能維持較低的pH,作為著色劑添加的紅曲橙色素也會發(fā)生明顯的顏色變化。

據(jù)Shi等[22]的研究結果,2種主要紅曲黃色素組分紅曲素和安卡紅曲黃素對pH不敏感,在pH2.5～8范圍內不會發(fā)生顏色變化。然而,在本研究中,紅曲黃色素F1在pH5～9范圍內,顏色及光譜發(fā)生了改變(圖3a)。由于紅曲黃色素F1中含有少量紅曲橙色素組分(圖2c,HPLC峰面積百分含量約為20%),由此推測紅曲黃色素F1顏色及光譜的變化是由于所含的少量不穩(wěn)定的紅曲橙色素所導致的。HPLC分析結果證實了這一推測。如圖2c、2d和圖4所示,在pH7的條件下,紅曲黃色素F1和紅曲橙色素F2所含的黃色素組分紅曲素(Y1,RT=17.38 min)和安卡紅曲黃素(Y2,RT=22.89 min)均可檢出,但二者所含的橙色素組分紅斑紅曲素(O1,RT=18.20 min)和紅曲玉紅素(O2,RT=24.10 min)均未檢出,且均在2.84 min出現(xiàn)一個新的流出峰。該新流出峰可能為紅曲橙色素降解所產(chǎn)生的小分子物質。

圖4 pH7條件下紅曲黃色素F1 和紅曲橙色素F2的HPLC分析Fig.4 HPLC analysis of the yellow fraction F1 and orange fraction F2 at pH7注:虛線所對應的位置標示橙色素 O1或O2所對應的保留時間。

2.3 光穩(wěn)定性分析

在紫外光(254 nm)的照射下,分析了紅曲黃色素F1和紅曲橙色素F2的光穩(wěn)定性,結果見圖5。隨著紫外光照射的時間延長,紅曲黃色素F1和紅曲橙色素F2顏色不斷變淺,照射270 min時,其色素殘留率分別為70.4%±0.2%和64.4%±0.9%,明顯高于姜黃色素的色素殘留量7.9%±0.7%(圖5a)。由此可見,紅曲黃色素和紅曲橙色素的光穩(wěn)定性均明顯優(yōu)于姜黃色素,其光穩(wěn)定性順序為紅曲黃色素>紅曲橙色素>姜黃色素。劉軼[24]通過密度泛函理論(DFT)和含時密度泛函理論(TDDFT)分析計算發(fā)現(xiàn),紅曲黃色素的光穩(wěn)定性最強,其次為紅曲橙色素,紅曲紅色素的光穩(wěn)定性最弱,本實驗結果與該理論計算十分吻合。

通過對比紫外光照射前后的光譜圖(圖5b和5c),發(fā)現(xiàn)紫外光不影響紅曲黃色素和紅曲橙色素的吸收光譜形狀和最大吸收波長,表明紫外光破壞紅曲黃色素和紅曲橙色素結構后,生成的新物質在300～600 nm范圍內沒有強吸收,除了引起褪色,不會引起色調的變化。本實驗現(xiàn)象與徐海笑[25]的結論一致。徐海笑[25]通過分析黃色素組分紅曲素的光處理產(chǎn)物的液相圖譜,發(fā)現(xiàn)除未反應的紅曲素之外,所有光降解產(chǎn)物的色譜峰對應的最大吸收波長均不超過275 nm。

圖5 紅曲黃色素F1和紅曲橙色素F2的紫外光穩(wěn)定性Fig.5 UV-light stability of the yellow fraction F1 and orange fraction F2

2.4 熱穩(wěn)定性分析

在60和80 ℃條件下分析了紅曲黃色素F1和紅曲橙色素F2的熱穩(wěn)定性,結果見圖6。由圖6a可知,紅曲黃色素F1表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性,處理120 min后,其在60和80 ℃下的色素殘留率性分別為94.3%±2.6%和87.4%±3.2%,與對照組的姜黃色素的色素殘留率無明顯差異(92.9%±0.6%和90.9%±4.5%)。相比之下,紅曲橙色素F2的熱穩(wěn)定性較差,隨著加熱時間的延長,色素殘留率急劇下降,60和80 ℃下處理120 min后,色素殘留率性分別為58.3%±7.1%和40.8%±1.9%。甘純璣[26]的研究也發(fā)現(xiàn)了紅曲黃色素具有良好的熱穩(wěn)定性,80 ℃加熱30 h后色素保存率達到90%以上。

紫外-可見光譜分析發(fā)現(xiàn),加熱處理前后,紅曲黃色素F1的吸收光譜形狀和最大吸收波長沒有發(fā)生明顯變化(圖6b),而紅曲橙色素F2的吸收光譜由1個吸收峰(470 nm)變成2個吸收峰(410和470 nm)(圖6c),推測加熱處理后紅曲橙色素結構受到破壞,生色團共軛體系縮小,最大吸收峰藍移,顏色由橙色逐漸轉為橙黃色。

圖6 紅曲黃色素F1和紅曲橙色素F2的熱穩(wěn)定性Fig.6 Thermal stability of the yellow fraction F1 and orange fraction F2

3 結論

紅曲黃色素是一種穩(wěn)定性好的紅曲色素組分,在pH2～9范圍內無明顯顏色變化;紫外光照射270 min后,色素殘留率(70.4%±0.2%)明顯高于對照組姜黃色素(7.9%±0.7%);80 ℃處理120 min后,色素殘留率(87.4%±3.2%)與對照組姜黃色素無明顯差異(90.9%±4.5%)。相比之下,紅曲橙色素的pH及溫度穩(wěn)定性較差,其穩(wěn)定的pH范圍為2～4,80 ℃處理120 min后,色素殘留率為40.8%±1.9%,約為紅曲黃色素殘留率的一半。但紅曲橙色素在光穩(wěn)定性方面與紅曲黃色無明顯差異,但明顯優(yōu)于對照組姜黃色素。該研究不僅可以為不同紅曲色素的應用范圍及條件提供參考,還可為高穩(wěn)定性紅曲色素產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。由于本研究是在特定的溶劑體系中進行的,環(huán)境條件與復雜的食品基質有很大差異,因此,紅曲黃色素和橙色素在不同種類食品中穩(wěn)定性及其它食品添加劑對紅曲黃色素和橙色素的影響還有待進一步研究。