付強(qiáng) 郭妍婷 楊莉 史慧君

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 830052)

牛病毒性腹瀉病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus,BVDV）屬于黃病毒科（Flaviviridae）、瘟病毒屬（Pestivirus），主要感染牛、羊、駱駝等家畜和野生動(dòng)物[1]，是牛病毒性腹瀉-黏膜?。˙ovine Viral Diarrhea-Mucosal Disease,BVD-MD）的主要病原之一[2]。該病毒感染成年動(dòng)物后常呈現(xiàn)隱性感染，一般不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，而幼畜感染后常造成腹瀉、高燒、白細(xì)胞減少、黏膜糜爛甚至脫落等癥狀，感染孕畜后造成流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和畸形胎、繁殖障礙等[3,4]。尤其是非致細(xì)胞病變型（Non-cytopathogenic Effect,NCP）BVDV 感染妊娠早期母畜，造成持續(xù)性感染（Persistent Infection,PI）犢牛的出現(xiàn)，PI 犢牛一旦再次感染CP 型BVDV 后表現(xiàn)出嚴(yán)重的腹瀉黏膜病，最終因脫水和代謝性酸中毒等致死率高達(dá)90%，而且PI 犢牛始終向外排毒，成為污染整個(gè)牛群的重要傳染源[5,6]。

BVDV 非結(jié)構(gòu)p7 蛋白在病毒復(fù)制過程中起到重要的作用。有研究報(bào)道，非結(jié)構(gòu)蛋白p7 翻譯后折疊并加工成六聚體形式，轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜上，組成離子孔道，所以p7 蛋白屬于離子孔道蛋白家族，主要參與介導(dǎo)一些離子（Na+、Ca2+、K+、H+等）運(yùn)輸，而且對(duì)病毒進(jìn)入細(xì)胞及子代病毒在細(xì)胞中成熟產(chǎn)生影響[7-9]。本研究開展BVDV 非結(jié)構(gòu)蛋白p7 的基因克隆及原核表達(dá)純化，以期獲得p7 蛋白，為后續(xù)構(gòu)建p7 的多克隆和單克隆抗體提供重要的材料和平臺(tái)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)菌、載體和cDNA

BL21（DE3）PLySs 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購自北京索萊寶科技有限公司；pCold-MBP 載體購自武漢淼靈生物科技有限公司；BVDV 毒株NADL 的cDNA 保存于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院動(dòng)物病毒實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑和儀器

考馬斯亮藍(lán)快速染色液、透析袋和5×蛋白上樣緩沖液購自北京索萊寶科技有限公司；Kpn I 和BamH I 購自NEB 公司；Taq PCR Mastermix、T4 Ligase、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒和普通質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；Ni-TED 瓊脂糖樹脂、NaH2PO4、NaCl、咪唑imidazole、瓊脂糖和異丙基-b-D-硫代半乳糖苷IPTG 購自生工生物工程（上海）股份有限公司；低溫高速臺(tái)式離心機(jī)Micro 21R 購自美國Thermo 公司；C1000 PCR 儀購自美國BioRad 公司；DYCP-31DN型核酸瓊脂糖水平電泳儀購自北京六一生物科技有限公司。

1.3 p7 基因克隆及測(cè)序分析

根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫中BVDV NADL（NC_001461.1）基因組序列中p7 基因，設(shè)計(jì)擴(kuò)增p7 基因引物為p7-F：5’CGGggtaccATGTCCCAGTATGGGGCAGGTG 3’；p7-R：5’ CG CggatccAGCCT TTGCCATCCCTCCAAC 3’，其中g(shù)gtacc 和ggatcc分別為Kpn I 和BamH I 酶切位點(diǎn)。以BVDV NADL cDNA 為模版，以p7-F 和p7-R 為引物，PCR 擴(kuò)增p7 基因，PCR 反應(yīng)體系見表1，PCR 反應(yīng)條件為95℃5min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，35 個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃∞。使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 結(jié)果，并使用瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒回收p7 基因，將p7 基因送至蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

表1 PCR 反應(yīng)體系

1.4 pCold-MBP-p7 原核表達(dá)載體構(gòu)建

使用Kpn I 和BamH I 對(duì)p7 基因和pCold-MBP 質(zhì)粒進(jìn)行酶切，酶切體系見表2，酶切反應(yīng)條件為37℃4 h。酶切反應(yīng)完成后使用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒將酶切后的p7 基因和pCold-MBP 載體回收，使用T4 DNA Ligase 將p7 基因和pCold-MBP 載體連接，連接反應(yīng)條件見表3，連接反應(yīng)條件為16℃過夜；將連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）PLySs 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布到含有氨芐西林的瓊脂平板中，37℃培養(yǎng)過夜，次日使用PCR 鑒定單克隆菌落，并將陽性克隆送至蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

表2 酶切反應(yīng)體系

表3 連接反應(yīng)體系

1.5 IPTG 誘導(dǎo)條件優(yōu)化

將pCold-MBP-p7 單克隆菌落接種至LB 肉湯培養(yǎng)基中擴(kuò)繁，擴(kuò)繁完成后以體積比1：100 比例接種至新的LB 肉湯培養(yǎng)基中，置于37℃200rpm 振蕩培養(yǎng)，待OD600 nm 為0.4～0.6時(shí)，分別加入終濃度0、0.6、0.8、1.0、1.2 mM IPTG，16℃條件下200rpm 振蕩過夜誘導(dǎo)表達(dá)；次日分別取1ml 培養(yǎng)物，8000rpm 離心5min 后棄掉上清，加入100μL 1×蛋白上樣緩沖液，使用SDS-PAGE 電泳分離蛋白質(zhì)，并使用考馬斯亮藍(lán)染色套裝（染色液+脫色液）進(jìn)行染色和脫色，具體染色和脫色步驟見試劑盒說明書。

1.6 pCold-MBP-p7 原核表達(dá)載體誘導(dǎo)表達(dá)和純化

pCold-MBP-p7 單克隆菌落擴(kuò)繁步驟同上，擴(kuò)繁后以體積比1：100 比例接種菌液至新的LB 肉湯培養(yǎng)基中，置于37℃200rpm 振蕩培養(yǎng)，待OD600nm為0.4～0.6 時(shí)，加入終濃度為1.2 mM IPTG，置于16℃低溫過夜誘導(dǎo)表達(dá)，次日離心收集菌體沉淀，加入10ml 裂解液（50 mM NaH2PO4，500mM NaCl，20mM imidazole，調(diào)節(jié)pH 至8.0）重懸沉淀，使用細(xì)胞超聲破碎儀（15s ON，15s OFF）進(jìn)行超聲破碎至液體清亮。8,000rpm 離心10min 去除細(xì)胞碎片，填加到Ni-TED 瓊脂糖樹脂中，4℃孵育4h 后使用3 倍柱體積的洗滌緩沖液（50mM NaH2PO4，500mM NaCl，40mM imidazole，調(diào)節(jié)pH 至8.0）進(jìn)行洗滌，加入洗脫緩沖液（50mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM imidazole，調(diào)節(jié)pH 至8.0）進(jìn)行4 次洗脫，收集洗脫溶液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳并使用考馬斯亮藍(lán)溶液染色進(jìn)行觀察。

1.7 蛋白透析及檢測(cè)

將透析袋裁剪成適當(dāng)長(zhǎng)度，置于2% NaHCO3和1mM EDTA 溶液中煮沸10min；使用蒸餾水清晰透析袋后，使用1mM EDTA 溶液煮沸透析袋10min，待冷卻后灌裝洗脫蛋白溶液，置于100 倍體積的磷酸鹽緩沖液（20mM，pH 7.0）放置于4℃下滲透過夜，次日轉(zhuǎn)移剩余蛋白溶液至15ml 離心管，取少量蛋白溶液進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，使用考馬斯亮藍(lán)溶液染色進(jìn)行觀察，其余置于-80℃為后續(xù)使用。

2 結(jié)果

2.1 p7 基因擴(kuò)增及pCold-MBP-p7 原核表達(dá)載體構(gòu)建

以BVDV NADL cDNA 為模版，使用PCR 擴(kuò)增p7 基因。如圖1 所示，PCR 產(chǎn)物大小約為225bp，與p7 基因大小一致；將p7 基因克隆至pCold-MBP 載體后，獲得pCold-MBP-p7 原核表達(dá)載體，質(zhì)粒圖譜見圖2。

圖1 PCR 擴(kuò)增p7 基因結(jié)果

圖2 pCold-MBP-p7 原核表達(dá)載體圖譜

2.2 IPTG 誘導(dǎo)條件優(yōu)化

加入不同濃度的IPTG 后低溫過夜誘導(dǎo)，次日收集菌體并使用SDS-PAGE 進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖3 所示，使用1.2mM IPTG 誘導(dǎo)后能蛋白表達(dá)量最高，所以后續(xù)試驗(yàn)使用1.2mM IPTG 作為誘導(dǎo)條件。

圖3 IPTG 誘導(dǎo)濃度優(yōu)化

2.3 pCold-MBP-p7 原核表達(dá)和蛋白純化

使用IPTG 誘導(dǎo)pCold-MBP-p7 表達(dá)過夜，收集菌體后破碎，使用Ni-TED 瓊脂糖樹脂進(jìn)行純化。結(jié)果如圖4 所示，MBP-p7 融合蛋白成功表達(dá)，約49kDa；經(jīng)過4 次洗脫液洗脫后大部蛋白已從瓊脂糖樹脂洗脫下來，得到雜帶較少的MBPp7 融合蛋白。

圖4 MBP-p7 蛋白純化

2.4 MBP-p7 蛋白透析

使用透析袋對(duì)MBP-p7 蛋白進(jìn)行透析，完成后使用SDS-PAGE進(jìn)行電泳，使用考馬斯亮藍(lán)染色進(jìn)行鑒定。結(jié)果如圖5 所示，透析后MBP-p7 蛋白條帶較為單一，表明MBP-p7 蛋白純度高。

圖5 MBP-p7 蛋白透析后鑒定

3 討論

黃病毒科非結(jié)構(gòu)蛋白p7 經(jīng)翻譯后加工聚集并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜上形成六聚體離子孔道形式，參與到離子跨膜運(yùn)輸、病毒侵入和釋放等過程，對(duì)病毒復(fù)制起到重要作用[10]。而目前關(guān)于p7 蛋白如何進(jìn)行聚集，在什么時(shí)間p7 蛋白開始聚集尚不清楚，本課題組正在開展BVDV p7 形成離子孔道的機(jī)制研究，而目前尚未見BVDV p7 蛋白相關(guān)的抗體銷售，開展本試驗(yàn)表達(dá)純化p7 蛋白，擬為后續(xù)p7 蛋白的多克隆抗體及單克隆抗體研發(fā)提供重要的材料。

本試驗(yàn)使用pCold-MBP 原核表達(dá)載體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)純化，其中pCold 屬于冷休克基因CSPA 啟動(dòng)子，在較低溫度下即可誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，進(jìn)而降低蛋白誘導(dǎo)過程中因溫度過高造成的蛋白聚集、變性、形成難溶物等情況發(fā)生[11]；MBP 蛋白標(biāo)簽是一種麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽，分子量約42.5 kDa，一般情況下將MBP 蛋白融合在目的蛋白的N 端，有利于減少目的蛋白的降解，提高蛋白的可溶性，維持蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，減少純化難度[12]。本試驗(yàn)使用pCold 實(shí)現(xiàn)低溫高效誘導(dǎo)表達(dá)，使用MBP 蛋白標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)維持蛋白穩(wěn)定性的作用。