邢家利,王禹歆,杜順達(dá)

邢家利,王禹歆,杜順達(dá),中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院肝臟外科 北京市 100730

0 引言

肝癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,包括肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)、肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)以及混合型[1].索拉非尼作為一線晚期肝癌治療藥物2007年上市,隨后侖伐替尼和二線瑞戈非尼也獲得了批準(zhǔn),給肝癌的藥物治療帶來(lái)了希望.然而,臨床實(shí)踐顯示它們的藥物應(yīng)答率較低,侖伐替尼的客觀應(yīng)答率(objective response rate,ORR)為24%,瑞戈非尼的ORR為11%,索拉非尼的ORR僅為3%[2-4].近年來(lái),免疫藥物的出現(xiàn),再次給肝癌的治療帶來(lái)了曙光,尤其是靶向藥物和免疫藥物的聯(lián)合應(yīng)用,但有效性仍然有限[5],肝癌患者的5年生存率低于20%[6].肝癌細(xì)胞耐藥性的出現(xiàn)以及腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜機(jī)制給肝癌的傳統(tǒng)治療帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn).

腫瘤細(xì)胞的耐藥性機(jī)制十分復(fù)雜,如腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)上調(diào)細(xì)胞表面的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體來(lái)增強(qiáng)自身的耐藥性,多藥耐藥(multi-drug resistance,MDR)基因可以編碼多種多藥耐藥蛋白(MDR protein,MRP),將不同種類(lèi)的藥物排出細(xì)胞[7].此外,腫瘤細(xì)胞還可以通過(guò)細(xì)胞周期機(jī)制[8]、染色質(zhì)修飾[9]、表觀遺傳學(xué)改變[10]、以及腫瘤干細(xì)胞[11]等復(fù)雜機(jī)制產(chǎn)生耐藥性.同時(shí),腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)中存在多種間質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞因子成分,機(jī)制復(fù)雜,在腫瘤的生長(zhǎng)、進(jìn)展和耐藥性方面扮演著重要的角色.

因此,通過(guò)系統(tǒng)研究肝癌細(xì)胞微環(huán)境,分析肝癌細(xì)胞對(duì)不同抗癌藥物反應(yīng),以及尋找分子標(biāo)志物,發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)等方法實(shí)現(xiàn)對(duì)肝癌患者的精準(zhǔn)治療是一項(xiàng)十分迫切的任務(wù)[12].在研究肝癌發(fā)病機(jī)制和藥物篩選時(shí),利用體外肝癌細(xì)胞模型系統(tǒng)對(duì)肝癌進(jìn)行適當(dāng)?shù)慕Ｊ且环N重要方式.目前體外肝癌細(xì)胞培養(yǎng)模型構(gòu)建主要采用包括2D細(xì)胞培養(yǎng)、類(lèi)器官、人源腫瘤異種移植模型、三維細(xì)胞培養(yǎng)模型及3D生物打印模型等方法.本文總結(jié)討論了目前不同類(lèi)型肝癌細(xì)胞體外培養(yǎng)模型的優(yōu)勢(shì)和局限性,重點(diǎn)對(duì)3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和3D生物打印技術(shù)進(jìn)行了探討,以期明確肝癌體外培養(yǎng)模型的應(yīng)用、將來(lái)的發(fā)展和研究方向.

1 體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞來(lái)源

1.1 細(xì)胞系源肝癌細(xì)胞 人肝癌細(xì)胞株是通過(guò)克隆培養(yǎng)法或通過(guò)篩選培養(yǎng)法從肝癌病理組織中分離出單細(xì)胞后,由單個(gè)細(xì)胞不斷分裂增殖形成的細(xì)胞群,具有與原代組織極為相似的特性和人體完整的遺傳基因,并能穩(wěn)定傳代.相較于人原代肝癌細(xì)胞,具有來(lái)源方便、操作簡(jiǎn)單、條件可控和可重復(fù)等優(yōu)點(diǎn).根據(jù)Cellosaurus數(shù)據(jù)庫(kù)(2017-05-22;http://web.Expasy.org/cellosaurus/),目前已有百余種肝癌細(xì)胞系;但可用細(xì)胞系的數(shù)量受到腫瘤分離后細(xì)胞體外生長(zhǎng)效率的限制,目前已經(jīng)發(fā)表的肝癌細(xì)胞系只有31種,如HepG2、HepaRG等[13].同時(shí)細(xì)胞系的使用可能受到細(xì)胞培養(yǎng)物與不同細(xì)胞系的其他細(xì)胞的污染的限制,在Cellosaurus數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)列出了幾個(gè)受污染的或被錯(cuò)誤識(shí)別的細(xì)胞系,如BEL7402、SMMC7721和SKHEP1等[14].

HepG2由Knowles等建系于1979年,是一種肝母細(xì)胞瘤,取自于一名高加索白人男性肝癌標(biāo)本[15].HepG2細(xì)胞呈上皮樣形態(tài),典型染色體數(shù)目為55個(gè),貼壁抱團(tuán)生長(zhǎng),生長(zhǎng)較快,傳代周期為1-2 d[16].HepG2細(xì)胞具有低轉(zhuǎn)移、裸鼠中成瘤率較差、AFP陽(yáng)性等特點(diǎn).目前通過(guò)實(shí)驗(yàn)已證實(shí),該細(xì)胞系分化程度較高,細(xì)胞里代謝酶的生物轉(zhuǎn)化特性較完整,不需加入外源性活化系統(tǒng)[17],常被用于體外肝細(xì)胞代謝或遺傳毒性試驗(yàn)方面[18].同HepG2細(xì)胞相比,HepaRG與人源原代肝細(xì)胞具有更多相似之處[19].在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)皿中,HepaRG細(xì)胞較人源原代肝細(xì)胞具有更穩(wěn)定的細(xì)胞表型[20],被視為人源原代肝細(xì)胞的最佳替代品[21].

1.2 人源原代肝癌細(xì)胞 在體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中,HepG2及HepaRG等肝癌細(xì)胞系已得到了廣泛的應(yīng)用,但細(xì)胞系細(xì)胞的表型與人源原代肝癌細(xì)胞之間存在有較多不同之處[22].原代肝癌細(xì)胞取自肝癌患者手術(shù)切除病灶,在體外消化離心后進(jìn)行多維培養(yǎng),被視為體外肝癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中金標(biāo)準(zhǔn),但在2D培養(yǎng)模式下,肝癌細(xì)胞會(huì)較快發(fā)生去分化最終導(dǎo)致肝細(xì)胞功能缺失[23].研究證明人源原代肝癌細(xì)胞在3D細(xì)胞模型長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中具有穩(wěn)定性,能夠穩(wěn)定分泌如白蛋白、激素等重要分子物質(zhì)[24,25].

2 二維肝癌細(xì)胞培養(yǎng)

二維腫瘤模型的研究已經(jīng)為腫瘤細(xì)胞的增殖和其他致瘤表型提供了一些啟示,但二維模型早已被證明具有局限性(表1),特別是在癌癥機(jī)制的研究和抗癌藥物的開(kāi)發(fā)方面[40,41].首先,在二維培養(yǎng)條件下,腫瘤組織中細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的相互作用以及局部缺氧微環(huán)境的特征難以模擬.其次,傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)肝癌模型主要基于各種肝癌細(xì)胞系,研究證明這些肝癌細(xì)胞系的基因表達(dá)模式發(fā)生了不可逆轉(zhuǎn)的變化,無(wú)法提供原始腫瘤的關(guān)鍵生物學(xué)特征[26,42].在藥物篩選方面,基于細(xì)胞系的二維體外肝癌模型已被廣泛開(kāi)展于肝癌藥物的臨床實(shí)驗(yàn),但細(xì)胞系由于存在基因漂變、部分細(xì)胞建系困難等因素影響而造成其實(shí)驗(yàn)結(jié)果在后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中并不一定有效[43].雖然基于二維培養(yǎng)的體外藥物篩選具備可進(jìn)行高通量篩選、便捷的巨大優(yōu)勢(shì),但極低的有效率卻增加了藥物篩選成本,使其逐漸被人源腫瘤異種移植模型所替代.

表1 肝臟腫瘤體外培養(yǎng)模型

3 人源肝癌異種移植模型

移植性肝癌小鼠模型是指將肝癌細(xì)胞株或人源肝癌組織塊移植到小鼠體內(nèi)形成的動(dòng)物模型,主要分為兩種,一種是將肝癌細(xì)胞系(HepG2、HuH7等)接種到免疫缺陷小鼠體內(nèi),稱(chēng)為CDX模型(cell-line-derived xenograft),另一種是將來(lái)源于患者的肝癌組織塊接種到免疫缺陷小鼠體內(nèi),稱(chēng)為PDX模型(patient-derived xenograft).相較于直接將細(xì)胞系移植到裸鼠體內(nèi)的CDX技術(shù),PDX模型由于直接來(lái)源于患者,不會(huì)如細(xì)胞系一般喪失異質(zhì)性和產(chǎn)生遺傳漂變,故能夠更好的保持原有的腫瘤形態(tài)、轉(zhuǎn)移特點(diǎn)、突變譜及藥物反應(yīng)[44].肝癌的PDX模型已應(yīng)用于藥物篩選、藥效評(píng)價(jià)、肝癌的發(fā)生發(fā)展等多個(gè)方面[45].Jiang等人[46]利用肝癌PDX模型發(fā)現(xiàn)GPC3-CART細(xì)胞能有效清除PDX中的腫瘤,GPC3-CART細(xì)胞有望成為肝癌的候選治療方式.Wang等人[47]在PDX肝癌模型的基礎(chǔ)上,利用納米載體將siRNA轉(zhuǎn)移到肝癌細(xì)胞中,與腫瘤特異性結(jié)合,顯著抑制Luc基因的表達(dá),為肝癌的治療提供了新的方向.

但PDX模型也有其固有的缺陷:一是其作為動(dòng)物模型,將人源腫瘤接種到小鼠上培養(yǎng)會(huì)受到宿主動(dòng)物的一定干擾,導(dǎo)致藥物反應(yīng)性最終出現(xiàn)差異[48];二是將人源原代腫瘤組織培養(yǎng)至可進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的數(shù)量需要耗費(fèi)數(shù)月的時(shí)間且代價(jià)高昂[49,50].近年來(lái),具有人類(lèi)免疫系統(tǒng)的人源化PDX小鼠模型正在開(kāi)發(fā)和應(yīng)用[51].未來(lái)如何提高皮下移植瘤的微環(huán)境相似性,提高肝內(nèi)移植的成功率,將是建立肝癌PDX模型的重要研究方向.

4 肝癌類(lèi)器官構(gòu)建

類(lèi)器官技術(shù)是一種基于基質(zhì)膠的體外三維培養(yǎng)技術(shù),最初被應(yīng)用于體外干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為組織器官的研究,近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建腫瘤類(lèi)器官.腫瘤類(lèi)器官能夠很好保留親代腫瘤的組織學(xué)特性、突變譜以及藥物反應(yīng)特點(diǎn)[52],同PDX模型相比,構(gòu)建時(shí)間也更短.肝癌類(lèi)器官已廣泛應(yīng)用于腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制、腫瘤干細(xì)胞和個(gè)體化藥物篩選等方面.Broutier等人[28]在培養(yǎng)肝癌類(lèi)器官時(shí)發(fā)現(xiàn)低分化肝癌的器官培養(yǎng)成功率接近100%,但所有高分化肝癌均未成功培養(yǎng)成功,腫瘤類(lèi)器官的培養(yǎng)則取決于腫瘤干細(xì)胞的干性.Zheng等人[53]通過(guò)對(duì)肝癌不同細(xì)胞亞群的單細(xì)胞基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn),腫瘤干細(xì)胞的異質(zhì)性會(huì)導(dǎo)致腫瘤的異質(zhì)性,因此類(lèi)腫瘤器官是研究肝癌干性的有力工具.尋找肝癌干細(xì)胞的靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)靶向藥物有望成為肝癌治療的有效手段.

但腫瘤類(lèi)器官技術(shù)在應(yīng)用上仍有諸多局限性:一是需要加入大量成分復(fù)雜、昂貴的細(xì)胞因子用以維持類(lèi)器官自身的腫瘤微環(huán)境;二是體外腫瘤類(lèi)器官的構(gòu)建成功率取決于腫瘤自身的增殖能力,如肝細(xì)胞肝癌等增殖率較低的腫瘤在體外構(gòu)建類(lèi)器官的成功率很低[28],這使得腫瘤類(lèi)器官技術(shù)的應(yīng)用面不如PDX模型廣泛[54].近年來(lái)基于同樣取材方案的腫瘤類(lèi)器官技術(shù)通過(guò)三維培養(yǎng)基質(zhì)作為載體,供給復(fù)雜的生長(zhǎng)因子用以模擬微環(huán)境,成功的構(gòu)建出體外腫瘤模型,具備相當(dāng)高的腫瘤同源性和藥物反應(yīng)相似度[52].在未來(lái)的研究中,類(lèi)器官若能與液態(tài)活檢相結(jié)合,可能有助于更全面、更準(zhǔn)確地探討肝癌的異質(zhì)性,分析不同肝癌細(xì)胞亞群協(xié)同作用導(dǎo)致腫瘤耐藥的分子機(jī)制.同時(shí),利用類(lèi)腫瘤器官尋找腫瘤特異性抗原,探索突破腫瘤免疫抑制微環(huán)境,或利用類(lèi)器官作為預(yù)測(cè)療效的工具,在免疫治療方面具有很好的應(yīng)用前景.

5 三維肝癌細(xì)胞培養(yǎng)

隨著類(lèi)器官技術(shù)在多種腫瘤模型構(gòu)建中得到成功應(yīng)用,研究者已經(jīng)普遍認(rèn)為三維體系下的細(xì)胞培養(yǎng)能夠更好的反映腫瘤異質(zhì)性、突變譜和藥物反應(yīng)性[52].三維培養(yǎng)下的細(xì)胞能夠在空間中立體分布,這為細(xì)胞因子、趨化因子的不同分布提供了前提條件[55].相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)腫瘤細(xì)胞在三維培養(yǎng)環(huán)境下能夠通過(guò)上調(diào)多重耐藥基因來(lái)增強(qiáng)自身的藥物抵抗性[56].

目前多種三維培養(yǎng)技術(shù)已被用于三維體外肝癌模型的構(gòu)建,如聚球體模型、生物反應(yīng)器、微制造技術(shù)相關(guān)3D肝癌細(xì)胞模型等.肝癌細(xì)胞聚球體培養(yǎng)模型是由肝癌細(xì)胞在一定的微環(huán)境中自組裝而成,聚集體模型中肝癌細(xì)胞存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)[57].Jung等人[34]使用Huh7肝癌細(xì)胞系設(shè)計(jì)了一種肝癌細(xì)胞球體方案,在球體內(nèi)加入人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)進(jìn)行共培養(yǎng),與單層細(xì)胞相比,含有HUVECs的Huh7細(xì)胞球體在更高濃度的抗癌藥物(阿霉素和索拉非尼)中存活.和聚球體模型相比,生物反應(yīng)器可以為培養(yǎng)的細(xì)胞提供三維動(dòng)態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境,有效改善長(zhǎng)期培養(yǎng)中的細(xì)胞間的物質(zhì)交換[58,59].?tampar等人[35]建立了一種利用動(dòng)態(tài)回轉(zhuǎn)器生物反應(yīng)器系統(tǒng)對(duì)人肝癌細(xì)胞(HepG2/C3A)球體進(jìn)行遺傳毒性測(cè)試的方法,將間接作用的遺傳毒性化合物和雜環(huán)芳胺以非細(xì)胞毒性濃度暴露于球體,測(cè)定DNA鏈斷裂水平和DNA損傷反應(yīng)基因的mRNA水平.與單層培養(yǎng)相比,在生物反應(yīng)器條件下生長(zhǎng)的HepG2/C3A球體的模型表現(xiàn)出更高的代謝酶編碼基因的基礎(chǔ)表達(dá)[35].微流控芯片主要基于微流體控制技術(shù)構(gòu)建,相較生物反應(yīng)器而言,微流控芯片能夠?qū)崿F(xiàn)簡(jiǎn)便高效的三維培養(yǎng),建立細(xì)胞之間的聯(lián)系,并且形成外界化學(xué)刺激信號(hào)在三維結(jié)構(gòu)細(xì)胞團(tuán)內(nèi)的梯度濃度分布[60,61].Zhang等人[36]基于肝癌細(xì)胞膜上表達(dá)的去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)與其配體的相互作用,開(kāi)發(fā)一種微流控裝置芯片捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs),獲利于微流體通道的小尺寸和微流體通道與細(xì)胞外延伸之間增強(qiáng)的局部地形相互作用,CTC血樣的捕獲率可達(dá)85%以上,并且可以有效地測(cè)試釋放的CTCs對(duì)化療藥物(索拉非尼或奧沙利鉑)的敏感性.隨著不同類(lèi)型三維肝癌細(xì)胞模型的出現(xiàn),它將更多地應(yīng)用于藥物敏感性和藥物代謝分析、肝毒性預(yù)測(cè)、肝癌干細(xì)胞研究等領(lǐng)域.

6 三維肝癌細(xì)胞生物打印

近些年,隨著3D打印技術(shù)的使用范圍從無(wú)機(jī)材料向生命體擴(kuò)大的同時(shí),一種全新優(yōu)化的體外肝癌細(xì)胞3D培養(yǎng)方式也隨之而來(lái).3D生物打印是一項(xiàng)新興的技術(shù),它使細(xì)胞和ECM材料能夠直接組裝成具有預(yù)先設(shè)計(jì)的幾何和結(jié)構(gòu)的復(fù)雜組織狀結(jié)構(gòu)[62,63].目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)體外打印肺泡[64]、心臟[65]和血管[66]等復(fù)雜結(jié)構(gòu).三維生物打印體借助精密工程學(xué)儀器的幫助,控制各個(gè)細(xì)胞成分的三維位置,從而還原組織中不同細(xì)胞具備不同分布的特點(diǎn),達(dá)到模擬體內(nèi)微環(huán)境的目的.

為了建立有效的3D生物打印模型,需要解決兩個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題,即生物墨水和細(xì)胞.生物墨水是提供樣品可打印性的重要組成部分[67],同時(shí)也提供了基于生物材料使用的模擬活體微環(huán)境.除了細(xì)胞和信號(hào)分子外,腫瘤微環(huán)境主要由細(xì)胞外基質(zhì)物質(zhì)組成,包括多糖、蛋白質(zhì)和蛋白多糖.這些物質(zhì)構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),支持和連接腫瘤組織結(jié)構(gòu),并調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生和生理活動(dòng)[68].

近來(lái),已有研究者利用3D生物打印技術(shù)來(lái)更長(zhǎng)時(shí)間的保持細(xì)胞活性及功能[69],Nakao等人利用生物打印機(jī)制造出與肝索結(jié)構(gòu)相似的名為“Canaliculi”的結(jié)構(gòu),并將原代肝細(xì)胞及“Canaliculi”結(jié)構(gòu)在膠原蛋白基質(zhì)下培養(yǎng),在后期的檢測(cè)過(guò)程中,他們發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞的功能可維持長(zhǎng)達(dá)4周時(shí)間.Chang等人[70]已經(jīng)成功嘗試?yán)枚鄬咏M織模型應(yīng)用在3D肝臟模型中,這種多層次組織中包含了鼠和人的肝臟細(xì)胞,并且可以利用這種結(jié)構(gòu)進(jìn)行藥物毒理實(shí)驗(yàn)以其他醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究.Yang等人[37]利用HepaRG細(xì)胞和生物墨水構(gòu)建3D生物打印肝器官,將其移植到肝衰竭小鼠體內(nèi),3D生物打印模型具有體內(nèi)肝功能并顯著提高了小鼠的存活率.Xie等人[38]采取6例肝癌患者原代肝癌細(xì)胞與明膠、海藻酸鈉混合制成生物墨水進(jìn)行打印,成功構(gòu)建三維生物肝癌模型.此模型保留了親本肝癌的特征,包括生物標(biāo)記物的穩(wěn)定表達(dá),基因改變和表達(dá)譜的穩(wěn)定維持,并且能夠直觀、定量地顯示抗癌藥物篩選結(jié)果.

三維生物打印相對(duì)于三維培養(yǎng)也有其固有的劣勢(shì).不論是常見(jiàn)機(jī)械擠出式打印機(jī),還是光固化等多種新形式的打印機(jī),應(yīng)用打印技術(shù)將細(xì)胞構(gòu)建成特定模型是一個(gè)需要大量前期工作,且實(shí)際操作時(shí)耗時(shí)也較長(zhǎng)的過(guò)程,而細(xì)胞長(zhǎng)期處于離開(kāi)培養(yǎng)基的生物墨水中也會(huì)影響其功能.此外,擠出式打印機(jī)的機(jī)械壓迫也會(huì)造成細(xì)胞損傷.這使得部分脆弱的原代細(xì)胞在打印后短時(shí)間就會(huì)死亡,無(wú)法成功構(gòu)建模型.這有賴(lài)于生物材料和機(jī)械工程技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展.3D生物打印目前仍處于初步發(fā)展階段,隨著打印程序、生物墨水配置、打印模型的不斷優(yōu)化,由肝癌細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞,如內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等其他細(xì)胞成分,組成的多細(xì)胞打印模型有助于探索肝癌的微環(huán)境與異質(zhì)性,以及擴(kuò)大不同抗肝癌藥物敏感實(shí)驗(yàn)的篩選范圍.目前我們主要通過(guò)評(píng)估肝癌細(xì)胞功能基因表達(dá)來(lái)比較3D打印模型生物學(xué)特性,未來(lái)可借助分析模型中肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)表型來(lái)重建腫瘤轉(zhuǎn)移環(huán)境.

7 結(jié)論

近些年,隨著人們對(duì)于體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞的微環(huán)境、細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)之間作用和體外肝癌細(xì)胞培養(yǎng)灌流的深入研究,越來(lái)越多的肝癌細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷玫街鸩綉?yīng)用.體外培養(yǎng)模型的最終目標(biāo),是可以廣泛應(yīng)用于肝臟疾病的研究,包括藥物代謝及分子學(xué)領(lǐng)域,并且性能穩(wěn)定.2D細(xì)胞培養(yǎng)、類(lèi)器官、異種移植、微流體芯片等模型在肝癌個(gè)性化治療研究方面取得了較多進(jìn)展,和其他技術(shù)的應(yīng)用,將會(huì)擴(kuò)大其應(yīng)用前景;但高度依賴(lài)腫瘤細(xì)胞增殖能力、基因表達(dá)在培養(yǎng)過(guò)程中的改變、操作耗時(shí)長(zhǎng)等因素在一定程度上限制了其轉(zhuǎn)化應(yīng)用于大規(guī)模研究的可能.就目前而言,隨著3D體外培養(yǎng)技術(shù)的成熟和發(fā)展,其將會(huì)在體外實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域會(huì)更加深入,在器官移植、終末期肝病和肝臟腫瘤精準(zhǔn)個(gè)體化治療等臨床應(yīng)用方面也將會(huì)起到不可替代的作用.