高 峰，王秀會(huì)，夏勝利，周小小，易存國，付備剛，沈 超，王明輝

(上海健康醫(yī)學(xué)院附屬周浦醫(yī)院 上海市浦東新區(qū)周浦醫(yī)院，上海 201318)

骨肉瘤是青少年常見的骨惡性腫瘤，多發(fā)于10～16歲，具有惡性程度高和預(yù)后差的特點(diǎn)。2009年以前骨肉瘤患者的5年生存率僅為45.7%，隨著新輔助化療技術(shù)在骨肉瘤治療中的應(yīng)用，骨肉瘤患者的生命質(zhì)量已得到較大提高[1]。新輔助化療技術(shù)治療骨肉瘤有兩個(gè)顯著弊端：①腫瘤細(xì)胞易迅速對(duì)化療藥物出現(xiàn)耐藥；②多藥耐藥(Multidrug resistance，MDR)導(dǎo)致化療藥物效能降低[2]。研究[3]指出，P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)會(huì)將化療藥物從胞內(nèi)泵出胞外，導(dǎo)致細(xì)胞毒藥物濃度降低，單純提高細(xì)胞毒藥物濃度來應(yīng)對(duì)MDR效果并不理想。因此，尋找能逆轉(zhuǎn)MDR作用且毒副作用較小的化療增敏劑對(duì)提高骨肉瘤的治療效果具有重要意義。雷公藤草本具有抗炎、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[4]。雷公藤甲素(Triptolide，TPL)是從雷公藤中提取的單體化合物，是雷公藤發(fā)揮活性的主要成分之一[5-6]。劉倩等[7]報(bào)道TPL可抑制肺小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549增殖和誘導(dǎo)凋亡。惠璐璐等[8]證實(shí)TPL可提高K562/A02細(xì)胞對(duì)阿霉素(Adriamycin RD，ADR)的敏感性。因此，本研究探討TPL體外給藥對(duì)骨肉瘤細(xì)胞MDR效應(yīng)的逆轉(zhuǎn)作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人骨肉瘤細(xì)胞株U2OS購自中科院上海細(xì)胞研究所；CCK-8試劑盒(批號(hào)：20170015)購自南京建成生物科技有限公司；實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)試劑盒(批號(hào)：A1852)、羅丹明-123(Rh123，批號(hào)：G1124)購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司；P-gp單抗(批號(hào)：557003)購自美國CST公司；磷酸化蛋白激酶B(p-AKT，批號(hào)：G1708)、人磷酸化磷酸肌醇3激酶(p-PI3K，批號(hào)：G1708)、多藥耐藥蛋白質(zhì)1(MDR1)單抗(批號(hào)：55510)購自美國Abcam公司；TPL(批號(hào)：2017002)和ADR(批號(hào)：2017014)購自山東天晟生物科技有限公司；維拉帕米(VER)注射液(批號(hào)：國藥準(zhǔn)字H31021343)購自上海禾豐制藥有限公司。

1.2 建立耐藥細(xì)胞株模型 耐藥細(xì)胞株U2OS/ADR使用濃度遞增法進(jìn)行誘導(dǎo)：取處于對(duì)數(shù)生長期U2OS細(xì)胞，無菌PBS沖洗后加入含ADR(10 μmol/L)的10%血清RPMI-1640培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)液并用胰蛋白酶消化處理成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/ml并接種于新的培養(yǎng)瓶(不含ADR的新鮮培養(yǎng)液)。待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，無菌PBS沖洗后加入含ADR(20 μmol/L)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。重復(fù)上述操作，直至U2OS細(xì)胞可在含1000 nmol/L ADR的培養(yǎng)液中生長為止。實(shí)驗(yàn)前脫藥1周，U2OS和U2OS/ADR細(xì)胞均采用含10%血清RPMI-1640培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 MTT法測定TPL對(duì)U2OS/ADR細(xì)胞增殖的影響 取處于對(duì)數(shù)生長期的U2OS和U2OS/ADR細(xì)胞消化后，調(diào)整密度為5×104/ml，加入96孔板中(100 μl/孔)，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)過夜。耐藥指數(shù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，加入不同濃度梯度的ADR。逆轉(zhuǎn)倍數(shù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，設(shè)置ADR濃度分別為10、20、40、80、160、320 μmol/L，實(shí)驗(yàn)組加入TPL(10 μmol/L)，陽性對(duì)照組加入VER(10 μmol/L)。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，于每孔中加入CCK-8工作液10 μl，混勻后避光孵育30 min，在490 nm處用酶標(biāo)儀讀取吸光值。逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=(U2OS/ADR IC50)/(加逆轉(zhuǎn)劑后U2OS/ADR IC50)。耐藥指數(shù)=(U2OS/ADR IC50)/U2OS IC50。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測U2OS/ADR細(xì)胞內(nèi)Rh123評(píng)估P-gp水平 取對(duì)數(shù)生長期U2OS和U2OS/ADR細(xì)胞，每孔中加入TPL(10 μmol/L)，繼續(xù)于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，然后加入10 μmol/L Rh123染液，1 h后消化收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞熒光信號(hào)強(qiáng)度(488 nm激發(fā)光，560 nm發(fā)射光)。Rh123陽性細(xì)胞數(shù)與P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)作用呈負(fù)相關(guān)。

1.5 Western blot檢測U2OS/ADR細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT、MDR1和肺耐藥相關(guān)蛋白(LRP)表達(dá)水平 采用 BCA蛋白定量法對(duì)樣本總蛋白濃度定量后在樣本中加入適量上樣緩沖液并吹打均勻，然后放入沸水中10 min，使蛋白發(fā)生變性，置于冰箱-20 ℃保存?zhèn)溆?。制備聚丙烯凝膠，將每孔10 μl樣品電泳分離1.5 h后轉(zhuǎn)膜2 h，脫脂奶粉封閉2 h。取出封閉的膜，TPBS沖洗3次，然后用PBS沖洗1次；p-PI3K、p-AKT、MDR1、LRP一抗(1∶500)常溫孵育12 h，TPBS沖洗3次，二抗(1∶50000)孵育30 min，TPBS沖洗3次，PBS沖洗1次。洗膜時(shí)間均為10 min/次。配置適量顯影液后均勻加于條帶上，凝膠成像系統(tǒng)掃描后使用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行分析。

1.6 qRT-PCR檢測U2OS/ADR細(xì)胞中MDR1基因mRNA表達(dá)水平 取處于對(duì)數(shù)生長期的U2OS和U2OS/ADR細(xì)胞，每孔中加入TPL(10 μmol/L)，37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，而后消化并收集細(xì)胞。TRIzol法提取樣本總RNA以后逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。MDR1上游引物序列為5’-AAAAAGATCAACTCGTACCACTC-3’，下游引物序列為5’-GCACA AAATACACCAACAA-3’。94 ℃變性3 min后，按下述條件擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)：95 ℃ 5 s，65 ℃ 35 s，72 ℃ 60 s。擴(kuò)增后72 ℃延伸5 min。

2 結(jié) 果

2.1 TPL對(duì)U2OS/ADR細(xì)胞增殖的影響 CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，TPL濃度為10 μmol/L時(shí)，U2OS/ADR細(xì)胞的生長速率有所限制，抑制率為(14.9±1.44)%，未超過15%，依然屬于低增殖毒性濃度，故后續(xù)研究使用的TPL濃度為10 μmol/L。

2.2 TPL對(duì)U2OS/ADR細(xì)胞對(duì)ADR敏感性的影響 見圖1。與對(duì)照組相比，TPL組使ADR對(duì)U2OS/ADR細(xì)胞生長的抑制作用提高(F=177.5,P<0.05)。ADR對(duì)U2OS、U2OS/ADR、TPL+U2OS/ADR、VER+U2OS抑制作用的IC50分別為(40.7±2.17)、(63.4±4.14)、(38.6±3.35)和(47.5±3.13)μmol/L(均P<0.05)。使用前述公式計(jì)算，耐藥指數(shù)和逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為1.56和1.64，提示TPL具有逆轉(zhuǎn)U2OS/ADR細(xì)胞MDR的作用。

圖1 TPL對(duì)U2OS/ADR細(xì)胞對(duì)ADR敏感性的影響

2.3 TPL對(duì)Rh123陽性U2OS/ADR細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響 見圖2。TPL組Rh123陽性信號(hào)計(jì)數(shù)與對(duì)照組相比提高(F=61.3，P<0.001)，相對(duì)比為2.12±0.17，提示TPL處理可抑制細(xì)胞膜P-gp對(duì)Rh123的外排作用。

注：與對(duì)照組相比，***P<0.001。空白組：U2OS；

2.4 TPL對(duì)U2OS/ADR細(xì)胞p-PI3K、p-AKT、MDR1和LRP蛋白表達(dá)的影響 見圖3。Western blot結(jié)果顯示，經(jīng)TPL處理后的U2OS/ADR細(xì)胞p-PI3K、p-AKT、MDR1和LRP蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比均降低(均P<0.05)。

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，***P<0.001?？瞻捉M：U2OS；對(duì)照組：U2OS/ADR；TPL組：U2OS/ADR+TPL10 μmol/L；VER組：U2OS/ADR+VER 10 μmol/L

2.5 TPL對(duì)U2OS/ADR細(xì)胞MDR1基因mRNA水平的影響 見圖4。經(jīng)TPL作用后，對(duì)照組細(xì)胞MDR1基因mRNA水平有所下降(F=72.0，P<0.001)；TPL組MDR1基因mRNA熒光強(qiáng)度為對(duì)照組的(21.3±1.07)%，組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=13.342，P<0.001)。

注：與對(duì)照組相比，***P<0.001?？瞻捉M：U2OS；

3 討 論

骨肉瘤化療耐藥的發(fā)生是一個(gè)涉及多因素、多水平、多基因的復(fù)雜過程，其發(fā)生機(jī)制主要與膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、腫瘤干細(xì)胞、細(xì)胞內(nèi)解毒系統(tǒng)、細(xì)胞凋亡等有關(guān)[9]。1976年，Juliano等首次發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞耐藥的重要機(jī)制——跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的藥泵作用，上述機(jī)制被稱為“經(jīng)典的MDR”。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是藥泵作用中最重要的泵蛋白，包括P-gp和多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)等[10]。當(dāng)這些蛋白質(zhì)與藥物結(jié)合時(shí)，會(huì)使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物排出到胞外，從而引起細(xì)胞內(nèi)藥物的有效濃度下降，產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞耐藥[11]。貴鵬等[12]發(fā)現(xiàn)MDR1和P-gp是引起骨肉瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物不敏感的機(jī)制之一。Celia等[13]報(bào)道MDR1的表達(dá)水平與骨肉瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性密切相關(guān)，MDR1水平越高，細(xì)胞對(duì)藥物敏的感性越低。本研究結(jié)果顯示，與U2OS組細(xì)胞相比，U2OS/ADR組細(xì)胞中MDR1和P-gp水平明顯升高，說明MDR1和P-gp的過度表達(dá)是骨肉瘤細(xì)胞MDR的重要機(jī)制。因此，抵抗上述骨肉瘤細(xì)胞MDR機(jī)制的最直接方法是逆轉(zhuǎn)由P-gp介導(dǎo)的MDR，潛在的干預(yù)方案主要有3種，包括抑制MDR1 基因的表達(dá)、抑制P-gp 活性以及抑制ATP 酶[14]。研究[15]表明，中藥單體對(duì)于逆轉(zhuǎn)介導(dǎo)的MDR具有毒性低、療效顯著的特點(diǎn)，成為研究的熱點(diǎn)?？鄥A可通過下調(diào)耐藥細(xì)胞T24/ADM中MDR1表達(dá)P-gp 逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的耐藥性[16]。Marsousi等[17]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素處理結(jié)直腸癌細(xì)胞Caco-2可顯著下調(diào)細(xì)胞P-gp mRNA表達(dá)水平，減少細(xì)胞內(nèi)羅丹明123外排效率。劉風(fēng)玲等[18]發(fā)現(xiàn)粉防己堿能下調(diào)耐藥細(xì)胞SKOV3/DDP中MDR1 mRNA 表達(dá)，部分逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的耐藥性。TPL是一個(gè)具有多重生物活性的天然產(chǎn)物，具有抗類風(fēng)濕、抗氧化和抗癌等功效[5]。前期研究[19-20]也表明，TPL有提高A549/DDP、K562/A02等細(xì)胞藥物敏感性的作用。但其作用機(jī)制尚不明確，對(duì)骨肉瘤細(xì)胞耐藥的作用尚未見報(bào)道。

本研究證實(shí)，TPL可以劑量依賴的方式抑制U2OS/ADR細(xì)胞增殖，TPL處理后U2OS細(xì)胞對(duì)ADR的敏感性提高。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示U2OS/ADR細(xì)胞內(nèi)Rh123下降，細(xì)胞膜表面P-gp表達(dá)水平上升，證實(shí)本研究采用的細(xì)胞模型U2OS抵抗ADR作用與腫瘤藥物外排相關(guān)蛋白的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。經(jīng)TPL處理后，U2OS/ADR細(xì)胞內(nèi)Rh123水平升高，膜表面P-gp信號(hào)下降，證實(shí)TPL具有逆轉(zhuǎn)MDR現(xiàn)象的作用。Western blot和qRT-PCR結(jié)果表明，TPL處理后U2OS/ADR細(xì)胞MDR1、LRP、p-PI3K和p-AKT水平下降，證實(shí)TPL可以影響PI3K/AKT信號(hào)通路，抑制與MDR現(xiàn)象密切相關(guān)的蛋白表達(dá)。

綜上所述，TPL具有抑制U2OS/ADR細(xì)胞生長、提高U2OS對(duì)ADR敏感性的作用，其機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT信號(hào)通路活化、下調(diào)U2OS/ADR細(xì)胞MDR1和LRP基因表達(dá)、抑制P-gp對(duì)細(xì)胞毒物質(zhì)的外排有關(guān)。