舒 放，王海峰，薛飛肖，呂海港

(1.西北大學(xué)附屬醫(yī)院 西安市第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 西安 710018；2.西安交通大學(xué)附屬紅會醫(yī)院麻醉科，陜西 西安 710054)

目前全球丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)感染者約7100萬人，慢性感染導(dǎo)致肝硬化和肝癌，甚至危及生命。近年來因受感染人口老齡化、口服抗病毒療法廣泛應(yīng)用等原因，全球HCV流行率快速下降[1]，但某些國家和地區(qū)注射毒品流行的增加在某種程度上部分抵消了這一下降，導(dǎo)致新的HCV感染增加[2-5]，僅靠治療仍不足以實(shí)現(xiàn)HCV感染的消除。由于獲得治療的機(jī)會有限、費(fèi)用較高、耐藥性、治愈后再感染等情況的存在，迫切需要制定預(yù)防HCV感染的有效措施，尤其是研發(fā)出廣譜有效的疫苗來阻止全球HCV傳播[6-7]?，F(xiàn)有研究[8-10]表明疫苗在機(jī)體細(xì)胞免疫及體液免疫反應(yīng)中能夠表現(xiàn)出持久性的抗病毒作用。在控制和預(yù)防傳染病方面，疫苗仍然是最具成本效益和最成功的干預(yù)措施[11]。病毒樣顆粒(Virus like particle，VLP)是不含病毒遺傳物質(zhì)顆粒，形態(tài)結(jié)構(gòu)與天然病毒相似的能自我裝配的病毒空殼，因此不具備感染性，但具有很強(qiáng)的免疫原性和生物學(xué)活性，廣泛應(yīng)用于疫苗研究領(lǐng)域[12-13]。本研究利用乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)S基因具有裝配VLP的特性，在其親水區(qū)和氨基端區(qū)插入HCV串聯(lián)中和表位抗原，通過定量測定乙型肝炎表面抗原(HBsAg)比較純化濃縮后的VLP含量，為后期HCV VLP疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 真核載體pCI-neo、重組質(zhì)粒pCI-HBS、pCI-NEmS、人胚胎腎細(xì)胞293T(HEK293T細(xì)胞)由唐都醫(yī)院韋三華教授惠贈(zèng)；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)購于Gibco;Lipofectamine 2000?轉(zhuǎn)染試劑購于Invivogen；重組乙型肝炎疫苗購于GlaxoSmithKline Biologicals;Amicon?Ultracell-15 100K離心過濾器購于Millipore;TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶AgeⅠ購于Thermo公司。

1.2 串聯(lián)HCV中和抗原表位合成 根據(jù)前期研究選擇了一個(gè) HCV E1 基因區(qū)保守的中和表位[ITGHRMAWDMMMNWS(氨基酸序列313～327位)]、兩個(gè)E2區(qū)具有廣譜交叉活性的中和表位[QLINTNGSWHIN(412～423)和GVPTYSWGENETD(523～535)]以及一個(gè)HVR1的模擬表位(ETYVSGGSAARNAYGLTSLFTVGPAQK)。四者之間用 AAY連接，進(jìn)行PCR擴(kuò)增構(gòu)建串聯(lián)多中和表位序列Em，兩端引入AgeⅠ酶切位點(diǎn)ACCGGT。

1.3 串聯(lián)HCV中和抗原表位嵌合入HBV S基因親水區(qū) pCI-HBS為親水區(qū)aa127～128位引入AgeⅠ酶切位點(diǎn)的重組質(zhì)粒，酶切體系中加入pCI-HBS 10 μl，10×緩沖液 0 2 μl，AgeⅠ酶2 μl，ddH2O 6 μl，37 ℃ 4 h進(jìn)行酶切。電泳后回收膠，純化至10 μl。將回收純化的pCI-HBS與Em進(jìn)行連接，5×緩沖液2 μl，pCI-HBS 2 μl，Em基因5 μl，T4連接酶1 μl，16 ℃過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，篩選正確克隆，擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，送測序后保留插入方向正確的質(zhì)粒，命名為pCI-S1EmS2。

1.4 制備VLP-NEmS和VLP-S1EmS2 HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中(雙抗)。細(xì)胞生長至密度80%時(shí)，用脂質(zhì)體法將pCI-S1EmS2和pCI-NEmS轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞，48 h后收集培養(yǎng)上清，2000 r/min離心15 min，除去細(xì)胞碎片等雜質(zhì)，用Amicon?Ultracell-15 100K離心過濾器以4000 g離心15 min，分別命名為VLP-NEmS和VLP-S1EmS2。

1.5 VLP濃縮及純化 將1.4中VLP-NEmS和VLP-S1EmS2分別鋪于9種濃度梯度的蔗糖溶液(20%～60%)上，置于Beckman超速離心機(jī)(Rotor SW41)28000 r/min超速離心16 h。從管底依次收集不同濃度層，每個(gè)濃度層取10 μl生理鹽水稀釋至200 μl，在羅氏E601電化學(xué)發(fā)光分析儀上對每個(gè)濃度層HBsAg臨界指數(shù)(Cut off index，COI)進(jìn)行測定，收集濃度最高的濃度層。用節(jié)流分子量8000～10000的透析袋在20 mmol/L Tris-HCl(8.0)中透析，48 h后將透析好的樣品經(jīng)0.22 μm濾器除菌，用Amicon?Ultracell-15 100K離心過濾器以4000 g離心15 min，得到純化、濃縮的VLP，-80 ℃凍存。

1.6 VLP定量測定 通過10次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)1.4、1.5實(shí)驗(yàn)步驟，轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后收集培養(yǎng)上清，經(jīng)過濃縮、純化制備病毒樣顆粒VLP-NEmS以及VLP-S1EmS2。電化學(xué)發(fā)光法對兩種VLP進(jìn)行HBsAg定量檢測，VLP-HBS及乙肝疫苗(HBsAg濃度為20×103ng/ml)作為對照。

2 結(jié) 果

2.1 HBV S基因及串聯(lián)中和表位序列Em擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果 見圖1。將HBV S基因及串聯(lián)多中和表位序列Em擴(kuò)增產(chǎn)物加樣至1%瓊脂糖凝膠(0.5 μl/ml溴化乙啶)進(jìn)行電泳，可見681 bp及255 bp擴(kuò)增片段，與預(yù)期相符。

M：DNA Marker 2000；1：HBV S基因擴(kuò)增產(chǎn)物；2：串聯(lián)中和表位序列Em擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 VLP-NEmS和VLP-S1EmS2蔗糖密度梯度離心結(jié)果 見圖2。分別收集1 ml/管的9層分離片段進(jìn)行HBsAg定量測定，結(jié)果在6號濃度(即45%濃度)蔗糖溶液中收集到的2種VLP濃度最高。

注：1～9號分別代表質(zhì)量體積百分比濃度為20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%蔗糖溶液

2.3 透析、濃縮后VLP濃度比較 見圖3。重復(fù)轉(zhuǎn)染、純化、濃縮制備VLP的過程，對10次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。VLP-NEmS、VLP-S1EmS2和非嵌合重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的VLP-HBS HBsAg均值分別為(5.83±0.53)×103ng/ml、(1.81±0.76)×103ng/ml和(6.27±0.47)×103ng/ml，其中VLP-S1EmS2低于VLP-HBS(t=16.83，P<0.05)，而VLP-NEmS與VLP-HBS均值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.542，P=0.157)。因此，HCV串聯(lián)中和抗原表位嵌合于HBV S基因氨基端胞外區(qū)形成的病毒樣顆粒包裝效率高于親水區(qū)。

注：與VLP-HBS比較，*P<0.05

3 討 論

傳統(tǒng)的疫苗研究直到20世紀(jì)80年代仍主要基于減毒或滅活病毒，在誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生有效T細(xì)胞及B細(xì)胞免疫應(yīng)答中顯示出良好功效，并能產(chǎn)生持久的免疫力[14]。主要?dú)w因于減毒病毒應(yīng)答能力、表面幾何形態(tài)重復(fù)性、顆粒特性、刺激產(chǎn)生先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)能力等幾個(gè)關(guān)鍵特性[15]，但是傳統(tǒng)疫苗在生產(chǎn)效能及對免疫缺陷患者安全性方面有其自身缺陷，因此人們需要尋找新的疫苗研發(fā)替代方案。

VLP疫苗具有大多數(shù)傳統(tǒng)疫苗的特性，由于缺少病毒基因組而無法復(fù)制，因此作為疫苗開發(fā)的安全性得以保證。大多數(shù)VLP外殼由幾個(gè)相同蛋白質(zhì)拷貝構(gòu)成，形成二十面體或螺旋(棒狀)結(jié)構(gòu)[16]。絕大多數(shù)VLP直徑在20～100 nm，這使得其能夠自由進(jìn)入淋巴管到達(dá)被膜下淋巴結(jié)并選擇性地被抗原提呈細(xì)胞所攝取[17]。許多病毒結(jié)構(gòu)蛋白都具有自主組裝成VLP的能力。VLP可以在170多種不同表達(dá)宿主系統(tǒng)中產(chǎn)生，包括細(xì)菌、昆蟲、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞以及植物細(xì)胞，某種程度上反映了VLP宿主譜的廣泛性。HBV S基因在沒有核心蛋白和基因組的參與下能夠自我裝配，在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生VLP并分泌至培養(yǎng)上清中，因其可以攜帶外源性蛋白，易于制備及純化，能增強(qiáng)外源性蛋白免疫原性，是公認(rèn)的較好表達(dá)載體。使用異源表達(dá)系統(tǒng)甚至可以獲得三聚體的復(fù)雜表位，如人類免疫缺陷病毒(HIV-1型)包膜糖蛋白[18]和流感病毒血凝素[19]的三聚體。

我們根據(jù)之前的研究，選取3個(gè)HCV抗原表位基因進(jìn)行串聯(lián)，分別嵌合于HBV S基因親水區(qū)及氨基端胞外區(qū)，構(gòu)建串聯(lián)嵌合基因的重組表達(dá)載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，在培養(yǎng)液上清中分別收集VLP。經(jīng)過濃縮及純化，以定量測定HBsAg的方法比較各種VLP濃度，反映HBV S基因不同區(qū)域嵌合HCV中和抗原表位表達(dá)載體生成VLP的效率。在之前的研究[20]中，我們將不同片段HCV抗原表位分別嵌合在HBV S基因親水區(qū)同一位置，并對其VLP形成情況進(jìn)行分析，經(jīng)濃縮、純化后，幾種VLP能夠與商品化的乙肝疫苗在HBsAg含量上達(dá)到同一數(shù)量級，但由于插入片段表位性質(zhì)及長短不同，收集的幾種VLP相比其濃度存在差異，主要表現(xiàn)為HBV S基因親水區(qū)插入的HCV表位序列越長，形成VLP的能力越弱。但理論上嵌合的HCV表位越長，涉及的抗原譜越廣，疫苗產(chǎn)生的有效應(yīng)答概率越大，所以在質(zhì)和量上產(chǎn)生了矛盾。為了驗(yàn)證插入表位氨基酸數(shù)量及位置對包裝VLP的影響，我們將3種HCV表位串聯(lián)形成較長的片段，分別嵌合在HBV S基因親水區(qū)及氨基端胞外區(qū)，構(gòu)建表達(dá)載體PCI-NEmS與PCI-S1EmS2，用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)上清中收集嵌合病毒樣顆粒VLP-NEmS與VLP-S1EmS2，經(jīng)過多輪重復(fù)實(shí)驗(yàn)分析嵌合方式對于VLP形成的影響。從HBsAg含量測定結(jié)果來看，胞外區(qū)嵌合VLP-NEmS與親水區(qū)VLP-S1EmS2濃度結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，胞外區(qū)含量較高。

綜上所述，HCV中和表位嵌合位置不同造成病毒樣顆粒的包裝能力差異，嵌合于胞外區(qū)氨基端比嵌合于親水區(qū)能夠更有效率地包裝出病毒樣顆粒，成為疫苗研發(fā)中可以參考的一種策略。本實(shí)驗(yàn)制備的VLP與商品化的乙肝疫苗達(dá)到相同數(shù)量級，能夠滿足后續(xù)HCV體外培養(yǎng)系統(tǒng)及免疫動(dòng)物評價(jià)中和抗體的實(shí)驗(yàn)要求，為誘導(dǎo)廣譜交叉保護(hù)作用中和抗體的HCV疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。然而，本研究雖然證明HCV串聯(lián)中和表位嵌合在HBV S基因氨基端胞外區(qū)比親水區(qū)包裝出的VLP效率高，但嵌合于HBV S基因不同部位是否能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生相同、有效的中和抗體水平以及交叉保護(hù)作用仍需要通過動(dòng)物模型及中和抗體評價(jià)系統(tǒng)做進(jìn)一步的研究。