閆 真，王雅玲，高 楓

(延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西 延安 716000)

脊髓損傷(Spinal cord injury，SCI)是世界范圍內(nèi)的一個公共衛(wèi)生問題，神經(jīng)炎癥在SCI繼發(fā)性損傷中起關(guān)鍵作用[1-3]。小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要先天免疫細胞，在神經(jīng)炎癥中發(fā)揮著重要作用。小膠質(zhì)細胞在脊髓損傷反應(yīng)中被迅速激活，導(dǎo)致多種信號級聯(lián)介導(dǎo)的促炎細胞因子上調(diào)。而過度的小膠質(zhì)細胞激活可導(dǎo)致促炎因子如白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和活性氧(ROS)過量產(chǎn)生，從而加重炎癥反應(yīng)及繼發(fā)性損傷[3-7]。

雷公藤甲素(Triptolide，TPL)是一種天然生物活性化合物，最早從中藥雷公藤根中提取分離得到，是雷公藤的主要生物活性成分。TPL具有抗風(fēng)濕、抗菌、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤藥理作用，因其對多種疾病的療效而引起研究者廣泛關(guān)注，但其臨床潛力仍有待充分發(fā)掘[8-10]。目前，細胞移植已成為SCI一種有效治療選擇，其原理側(cè)重于減弱小膠質(zhì)細胞的激活，抑制相關(guān)細胞因子的產(chǎn)生，以減少炎癥和SCI[11-13]。我們認(rèn)為調(diào)節(jié)由過度活躍的小膠質(zhì)細胞引起的炎癥障礙可能是一種有前景的SCI治療方法，因此本研究以脂多糖(LPS)刺激的BV2小膠質(zhì)細胞和SCI小鼠模型為對象，探討TPL對SCI的影響及可能分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與細胞株 C57小鼠45只，6周齡，體重為100～120 g，購自上海模式生物科技股份有限公司，合格證號：SCXK(滬)2016-0008；常規(guī)飼養(yǎng)，給予食物與水分，溫度為20～24 ℃，空氣相對濕度為50%，正常晝夜更替(12 h光照/12 h黑暗)。BV2細胞系購自中國科學(xué)院上海生化研究所。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基；胎牛血清(FBS)；青鏈霉素(15140-122，Gibco)；二甲基亞砜(DMSO)；TPL(645900，Sigma)；LPS(L4391，Sigma)；小鼠TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(E-EL-M0049c，伊萊瑞特)；小鼠IL-6 ELISA 試劑盒(E-EL-M0044c，伊萊瑞特)；小鼠IL-1β ELISA試劑盒(E-EL-M0037c，伊萊瑞特)；一氧化氮(NO)測定試劑盒(A013-2-1，南京建成)；NOD樣受體蛋白3(Nod-like receptor protein 3，NLRP3)抗體(DF7438，119 kD，Affinity)；IL-1β抗體(abx131988，53 kD，Abbexa)；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)抗體(AF6270，131 kD，Affinity)；TNF-α抗體(17590-1-AP，26 kD，Proteintech)。

1.3 SCI小鼠模型制備及分組 參考文獻[14]進行SCI小鼠造模(30只)。造模后，15只作為SCI組；對另外15只小鼠連續(xù)注射TPL[0.2 mg/(kg·d)] 7 d(TPL組)后，進行HE染色分析、運動康復(fù)評估、炎癥因子分析、蛋白檢測等。以正常小鼠為對照組(15只)。

1.4 細胞培養(yǎng)及分組 BV2細胞于含DMEM、10% FBS、1%青鏈霉素的完全培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)箱37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。待細胞融合度達到80%時隨機分對照組、LPS誘導(dǎo)組和TPL處理組。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，LPS誘導(dǎo)組采用100 ng/ml LPS處理細胞24 h；TPL處理組先用TPL(50 nmol/L)處理細胞30 min，再加LPS(100 ng/ml)處理24 h。收集細胞或細胞上清進行后續(xù)實驗。

1.5 HE染色 小鼠組織脫水后二甲苯透明。透明后的組織塊依次經(jīng)3缸石蠟(60 ℃)進行浸蠟并包埋，并依次進行切片、烤片并脫蠟。于Mayer氏蘇木素染液中染色5 min，自來水洗浸洗返藍，于1%水溶性伊紅染液中染色5 min，風(fēng)干后中性樹膠封片、鏡檢。

1.6 運動功能評分(BBB) 術(shù)后7 d將三組小鼠放入開口盆中，輕敲盆壁使其爬行，由2名研究人員觀察小鼠臂、膝、踝關(guān)節(jié)行走、軀干運動及其協(xié)調(diào)情況并參考文獻[15]進行評分，總分21分，0分為無運動能力，評分高低代表運動能力強弱。

1.7 ELISA檢測 收集SCI組血清或BV2細胞上清，按照ELISA試劑盒操作說明依次加入生物素化抗體工作液、酶結(jié)合物工作液、顯色底物、終止液，并于酶標(biāo)儀上在450 nm波長處測量各孔光密度(OD值)。

1.8 NO檢測 采集小鼠血液或細胞上清，按照說明書依次加入反應(yīng)液，加樣完成后混勻樣本，靜置10 min，550 nm酶標(biāo)儀比色，測各孔OD值。NO含量(μmol/L)=(測定OD值-空白OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(100 μmol/L)。

1.9 Western blot檢測 利用RAPI裂解液提取小鼠組織中總蛋白及BV2細胞總蛋白，利用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液煮沸制備樣本，電泳分離蛋白樣品并轉(zhuǎn)膜，孵育對應(yīng)一抗、二抗，滴加ECL發(fā)光液于PVDF膜上反應(yīng)數(shù)分鐘，待熒光帶明顯后用濾紙吸去多余的底物液，覆上保鮮膜，X光膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影，沖洗膠片。晾干膠片，掃描膠片，用Band Scan分析膠片灰度值。

1.10 免疫熒光檢測 固定細胞爬片(4%多聚甲醛)，0.5 % Triton X-100通透15 min后使用封閉液對細胞封閉30 min。一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫避光孵育1 h，滴加一滴封片劑封片后，熒光顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié) 果

2.1 三組小鼠脊髓組織病理及BBB評分比較 造模7 d后， SCI組脊髓組織結(jié)構(gòu)紊亂和組織排列異常嚴(yán)重，經(jīng)TPL處理后得到明顯改善(圖1A)。同時，TPL組BBB評分優(yōu)于SCI組(圖1B)。

注：與對照組比較，*P<0.05；與SCI組比較，#P<0.05

2.2 三組小鼠脊髓組織促炎細胞因子水平比較 見表1。SCI組小鼠脊髓組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平較對照組明顯升高(均P<0.05)。注射TPL(TPL組)可顯著降低IL-1β、IL-6和TNF-α水平(均P<0.05)。

表1 三組小鼠脊髓組織促炎細胞因子表達水平比較(pg/ml)

2.3 三組小鼠iNOS及NO水平比較 見圖2。SCI組iNOS及NO水平較對照組升高，而TPL組可顯著下調(diào)iNOS及NO水平(均P<0.05)。

注：與對照組比較，*P<0.05；與SCI組比較，#P<0.05

2.4 三組小鼠NLRP3及IL-1β水平比較 見圖3。SCI可促進NLRP3及其相關(guān)蛋白IL-1β的表達，而TPL可顯著抑制這些蛋白的表達。

注：與對照組比較，*P<0.05；與SCI組比較，#P<0.05

2.5 三組BV2細胞促炎細胞因子水平比較 見表2。LPS刺激24 h可加速BV2小膠質(zhì)細胞IL-1β、IL-6、TNF-α的釋放，而用TPL孵育后IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯受到抑制。

表2 三組BV2細胞促炎細胞因子水平比較(pg/ml)

2.6 三組BV2細胞NO及iNOS水平比較 LPS處理24 h后BV2細胞中NO水平增加，經(jīng)TPL處理后NO水平下降(圖4A)。Western blot檢測結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)BV2細胞在蛋白水平上增加iNOS表達，而TPL處理可顯著下調(diào)iNOS表達(圖4B、C)。

注：與對照組比較，*P<0.05；與LPS誘導(dǎo)組比較，#P<0.05

2.7 三組BV2細胞NLRP3及IL-1β水平比較 LPS刺激可促進NLRP3及其相關(guān)蛋白IL-1β在BV2小膠質(zhì)細胞中的表達，TPL則可顯著抑制這些蛋白的表達(圖5A、B)。此外，經(jīng)過TPL處理的BV2細胞NLRP3在核內(nèi)熒光強度降低(圖5C)。

注：與對照組比較，*P<0.05；與LPS誘導(dǎo)組比較，# P<0.05。C圖為免疫熒光染色(×400)

3 討 論

TPL是中藥雷公藤中主要的生物活性化合物，在我國被廣泛用作治療藥物已有數(shù)百年歷史[5-7]。雖然TPL在抗炎方面的體內(nèi)研究取得了相當(dāng)大的進展，但其在SCI中是否具有抗炎作用及其具體的機制尚不清楚。最近的實驗表明，多種促炎細胞因子，如巨噬細胞遷移抑制因子(MIF)、IL-1β、IL-6和TNF-α等，在脊髓壓迫損傷后持續(xù)升高?？寡姿幬锿ㄟ^M1/M2表型變化調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞極化，減少神經(jīng)炎癥反應(yīng)，進而抑制SCI誘導(dǎo)的繼發(fā)性組織損傷的產(chǎn)生和擴大[11-12,16-17]。

NO是一種氣體化學(xué)信使，是已知的生物活性最小的分子。低濃度NO與中樞神經(jīng)系統(tǒng)生理過程密切相關(guān)，如突觸可塑性、受體功能和神經(jīng)遞質(zhì)釋放。在包括SCI在內(nèi)的病理條件下，NO主要由iNOS合成，在小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞和血管平滑肌細胞中大量表達。然而，大量NO會導(dǎo)致氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，形成神經(jīng)系統(tǒng)疾病[18-19]。NLRP3炎癥小體是研究最廣泛的炎癥小體，其參與無活性Caspase-1前體轉(zhuǎn)化為活性形式過程。一旦激活，Caspase-1蛋白水解將促炎細胞因子IL-1β前體和IL-18前體轉(zhuǎn)化為成熟IL-1β和IL-18，這可以驅(qū)動一個強大的炎癥級聯(lián)反應(yīng)，最終放大炎癥反應(yīng)。在嚙齒動物SCI模型中，抑制NLRP3炎癥小體具有顯著的神經(jīng)保護作用，表明NLRP3炎癥小體是SCI過程中的重要介質(zhì)。因此，NLRP3炎癥小體可能成為SCI藥物治療的新靶點。此外，NLRP3炎性小體的藥物抑制劑BAY 11-7082或A438079可以促進小鼠SCI模型術(shù)后的神經(jīng)恢復(fù)[19-21]。這些發(fā)現(xiàn)表明NO分子和NLRP3炎癥小體可能是脊髓損傷治療的靶點。

因此，本研究首先探究了TPL在BV2小膠質(zhì)細胞中的抗炎作用，結(jié)果表明TPL能夠抑制LPS誘導(dǎo)的BV2細胞的炎癥反應(yīng)，抗炎作用包括減少促炎細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達，同時抑制iNOS表達從而抑制NO釋放。機制分析表明，TPL的抗炎作用可能是通過抑制NLRP3炎性小體表達而實現(xiàn)的。其次，我們探究了TPL對SCI小鼠的作用，發(fā)現(xiàn)TPL提高了SCI小鼠的BBB評分，即TPL能有效促進SCI小鼠后肢運動功能的恢復(fù)。同時，HE染色觀察脊髓形態(tài)學(xué)變化發(fā)現(xiàn)SCI組小鼠脊髓組織結(jié)構(gòu)紊亂和組織排列異常嚴(yán)重，而TPL明顯改善了SCI小鼠脊髓組織學(xué)形態(tài)。因此，TPL減輕了損傷組織紊亂，改善了術(shù)后運動功能。另外，SCI小鼠分子生物學(xué)實驗結(jié)果與LPS誘導(dǎo)的BV2細胞一致，TPL處理抑制了SCI引起的脊髓組織IL-1β、IL-6、TNF-α高表達，亦可通過抑制iNOS表達進一步抑制NO釋放，并且通過抑制NLRP3炎性小體表達在SCI小鼠中發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，TPL可通過抑制NLRP3通路及iNOS-NO通路在BV2小膠質(zhì)細胞及SCI小鼠模型中發(fā)揮抗炎作用，為SCI的治療用藥提供了理論支持。