邸金娜，劉敬禹，張 莉

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院呼吸內(nèi)科，遼寧 錦州 121001)

肺癌大多起源于支氣管黏膜上皮，也稱支氣管肺癌。據(jù)統(tǒng)計，2019年全球有1810萬新增癌癥患者，我國癌癥患者約380.4萬例，其中肺癌發(fā)病率為11.8%，病死率為18.4%[1]。而非小細胞肺癌(Non-small-cell lung cancer，NSCLC)可占所有肺癌病例的83%，其5年相對生存率僅為18%[2-3]。近年來中藥在預(yù)防及治療NSCLC上顯現(xiàn)出獨特優(yōu)勢，并逐漸受到研究者的重視。人參作為常用的中藥材，具有大補元氣、復(fù)脈固脫、補脾益肺等功效，臨床上應(yīng)用廣泛。大量研究[4-6]表明，人參可通過抑制細胞增殖、誘導(dǎo)細胞周期阻滯、促進細胞凋亡、影響細胞分化等達到治療NSCLC的目的。但因人參成分復(fù)雜，對于其治療NSCLC的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及機制，目前仍不明確。基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，本研究構(gòu)建“成分-靶點-疾病-通路”蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測人參治療NSCLC核心靶點及機制，為人參治療NSCLC提供參考。

1 資料與方法

1.1 人參活性成分收集 以“人參”為檢索詞，從中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)對所有藥物成分數(shù)據(jù)庫進行篩選和構(gòu)建。篩選條件：口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18[7]。搜索中醫(yī)藥整合藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)計算研究平臺(TCMIP，http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php)整合藥物潛在活性成分和相應(yīng)靶標信息，獲得人參活性成分-靶點數(shù)據(jù)，導(dǎo)入Cytoscape軟件，建立人參-靶點PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.2 NSCLC-靶點PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用比較毒物遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫(CTD，http://ctd.mdibl.org)、基因名片數(shù)據(jù)庫(Gene Cards，https://www.genecards.org)和療效藥靶數(shù)據(jù)庫(TTD，http://db.idrblab.net/ttd/)，以關(guān)鍵詞“non-small-cell carcinoma”檢索獲取NSCLC基因。通過Draw Venn Diagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)將人參和NSCLC基因進行整合，選取交集基因?qū)隒ytoscape軟件建立NSCLC-靶點PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.3 人參-靶點-NSCLC PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Cyto NCA插件對交集網(wǎng)絡(luò)進行分析[8]，建立人參-靶點-NSCLC PPI網(wǎng)絡(luò)。保存PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)文件，根據(jù)Degree值中位數(shù)篩選核心靶點。

1.4 基因富集分析 運用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)對核心靶點進行基因本體論(GO)注釋和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析。以P≤0.01為限定條件，從基因生物功能和信號通路角度進一步明確人參對NSCLC的作用機制。

1.5 分子對接模擬 利用RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)輸入相關(guān)蛋白質(zhì)名字，并下載mol2格式靶點結(jié)構(gòu)文件，通過軟件Auto Dock Tools1.5.6調(diào)整X、Y、Z坐標并進行分子對接模擬。對接完成后用DS軟件顯示對接后作用力。若對接評分<4.25，則分子和靶點親和力不強；>4.25，則有中等親和力；>5，則有較強親和力；>7，則有強烈親和力[9]。

2 結(jié) 果

2.1 人參-靶點PPI網(wǎng)絡(luò) 見圖1。根據(jù)TCMSP共篩選出22個人參成分，其中馬爾肯久納醇(Malkangunin)、五味子酯乙(Gomisin B)、菊黃質(zhì)(Chrysanthemaxanthin)、苯代南蛇堿(Celabenzine)成分無對應(yīng)靶點蛋白，進一步檢索人參18個成分作用靶點共118個。將人參成分及對應(yīng)靶點導(dǎo)入Cytoscape軟件，生成人參成分-靶點PPI網(wǎng)絡(luò)。

圖1 人參成分-靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

2.2 NSCLC-靶點PPI網(wǎng)絡(luò) 通過TTD篩選出22348個NSCLC靶點蛋白，通過Gene Cards和CTD分別篩選得到4180個和148個靶點蛋白，進一步利用Veen篩選出79個共有靶點，并利用Cytoscape軟件生成NSCLC-靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示與NSCLC相關(guān)節(jié)點蛋白質(zhì)3675個，邊緣蛋白質(zhì)85921個。

2.3 篩選核心靶點 建立“人參成分-靶點-NSCLC”PPI交集網(wǎng)絡(luò)(圖2)，最終可以得到93個核心靶點蛋白。分析PPI網(wǎng)絡(luò)中靶點Degree值，最大值為12，中位數(shù)為2。將靶點篩選條件范圍設(shè)置為4～12，篩選得到26個核心靶點蛋白。

圖2 人參-靶點-NSCLC PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO注釋分析和KEGG通路分析 GO注釋分析結(jié)果顯示有9個基因有注釋數(shù)據(jù)，42個生物過程中有富集，其中符合P≤0.01的生物過程有12個。KEGG通路分析結(jié)果顯示有26個基因有注釋數(shù)據(jù)，56條通路有富集，其中符合P≤0.01的信號通路有35條。GO注釋分析和KEGG通路分析共同富集結(jié)果有細胞周期(Cyclin)、表皮生長因子受體(EGFR)信號通路、鼠雙微體(MDM)2/4信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路等。

2.5 人參成分與NSCLC靶點模擬對接結(jié)果 見圖3。人參成分與PIK3CG、CDK2、EGFR、MET等成分具有較強親和力。通過DS軟件分析發(fā)現(xiàn)，人參成分與以上靶點均可形成H鍵及疏水作用，其中人參成分中西托糖苷(Alexandrin)、灌木遠志酮 A (Frutinone A)、原阿片堿(Fumarine)等成分評分均優(yōu)于EGFR抑制藥奧希替尼(對接評分=8)和MET抑制藥克唑替尼(對接評分=8)。分子對接結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)篩選結(jié)果一致，且人參活性成分與陽性藥奧希替尼和克唑替尼相比，分子對接吻合度比上市的陽性藥物效果更好。

圖3 人參成分與NSCLC靶點對接評分

3 討 論

本研究通過TCMSP篩選人參有效活性成分，顯示人參有380種成分，其中滿足條件的有鄰苯二甲酸二異辛酯(Diop)、豆甾醇(Stigmasterol)、β-谷甾醇(β-sitosterol)等22個成分，進一步篩選出各成分對應(yīng)的靶點共118個，構(gòu)建成分-靶點PPI網(wǎng)絡(luò)。再利用TTD、GAD、Gene Cards篩選出79個NSCLC作用靶點，并構(gòu)建疾病-靶點PPI網(wǎng)絡(luò)。通過將兩個PPI網(wǎng)絡(luò)整合建立成分-靶點-疾病PPI網(wǎng)絡(luò)，其中CDK2、EGFR、MDM2等26個靶點的Degree值較高，確定為人參治療NSCLC潛在核心靶點。通過富集分析發(fā)現(xiàn)，人參成分可通過干預(yù)細胞周期、EGFR信號通路、MDM2/4信號通路、MAPK信號通路等發(fā)揮治療NSCLC的潛在作用。

人參中的灌木遠志酮 A(Frutinone A)、原阿片堿(Fumarine)、吉九里香堿(Girinimbin)、高麗槐素(Inermin)、蘇齊內(nèi)酯(suchilactone)均可與靶蛋白EGFR、原癌基因蛋白質(zhì)(MET)顯現(xiàn)出良好的分子對接活性，9種活性成分和EGFR靶蛋白的對接區(qū)域與內(nèi)源性配體結(jié)合位置基本相同，因此可能起到和內(nèi)源性配體相同的作用，且人參活性成分與陽性藥奧希替尼和克唑替尼相比，分子對接吻合度比上市的陽性藥物效果更好。研究[10-12]表明，EGFR基因突變發(fā)生于39%～81%的NSCLC患者，與癌胚抗原基本一致。EGFR屬于受體酪氨酸激酶(RTK)的ErbB家族，EGFR突變可持續(xù)激活下游通路，促進增殖、存活、侵襲和血管生成[13]。而PI3K-AKT通路是EGFR的主要下游信號通路之一，當(dāng)EGFR發(fā)生突變時，PI3K-AKT通路被持續(xù)激活，加速NSCLC的進展[14]。有研究[15-16]表明，EGFR基因突變還能通過激活下游MAPK信號通路上調(diào)程序性死亡受體-1(PD-1)、程序性死亡受體-配體1(PD-L1)和細胞毒T淋巴細胞抗原4蛋白的表達，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生免疫逃逸。此外，EGFR調(diào)控的信號通路還有FoxO、PLC-g以及RAS-RAF-MEK等[16-18]。

MDM2/4基因在NSCLC發(fā)生及發(fā)展中越來越被重視，是最為重要的負性調(diào)控因子。如果改變MDM2/4蛋白水平，MDM2/4和p53之間的平衡就會受到破壞[19]。p53作為一種編碼的核磷蛋白，被廣泛認為是細胞中一種重要的腫瘤抑制因子[20-21]，人參中β-谷甾醇、苯代南蛇堿(Celabenzine)、原阿片堿、人參皂苷Rg5(Ginsenoside Rg5)MDM2/4蛋白具有較強的親和力，因此以上活性成分可通過調(diào)控MDM2/4蛋白來控制p53水平，從而達到治療NSCLC的目的。

除EGFR、MET、MDM2/4外，人參治療NSCLC的作用機制還可能是通過抑制腫瘤細胞有絲分裂、抑制PI3K-AKT信號通路激活、參與cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過程影響腫瘤基因的表達，充分體現(xiàn)出了人參治療NSCLC具有多靶點、多通路的特點。盡管有這些重要發(fā)現(xiàn)，本研究仍存在許多局限性：首先，由于信息不完整，可能忽略了某些化合物在NSCLC中的作用。其次，我們還未進行臨床研究和動物模型實驗，具體機制尚不清楚，需要在臨床實驗中進一步分析。因此，有必要進一步研究人參重要的單一組分在病理過程和特定靶標中的功能。