李佳婷，柳雅馨，宋 琪，王藝華，沈奕漩，馮旭凱，劉 斌

（西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西楊凌 712100）

食源性致病菌引起的食源性疾病是全球范圍內(nèi)最重要的食品安全問題之一，而金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）則是在其中排列前位的致病菌，也是臨床上人類化膿感染中最常見的病原菌之一[1]。金黃色葡萄球菌擁有多種毒力基因，會分泌超抗原外毒素（pyrogenic toxin superantigens，SAgs）、溶細胞素和其他外切酶等毒力因子。超抗原外毒素是一類分泌型毒力因子，包括中毒性休克綜合征毒素-1（toxic shock syndrome toxin 1，TSST-1）、葡萄球菌腸毒素（staphylococcal enterotoxins，SEs）和類腸毒素蛋白（staphylococcal enterotoxin-like toxins，SEls），其中危害最大的是葡萄球菌腸毒素[2-4]。金黃色葡萄球菌引起食物中毒通常是因攝入含有腸毒素污染的食物引起的，金黃色葡萄球菌經(jīng)80 ℃、30 min的加熱可以將其徹底殺死，腸毒素具有耐熱性，一般的烹調(diào)溫度難以將其破壞，這使其能夠順利進入到體內(nèi)而不喪失活性，且腸毒素對胃蛋白酶、胰蛋白酶以及低酸度的環(huán)境均具有抗性，攝入后會在消化道中產(chǎn)生毒性作用，當人進食了含有由金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的腸毒素污染的食物，就可引起食物中毒，會有嘔吐、惡心、腹瀉、腹痛等相關癥狀[5-6]。迄今為止，已經(jīng)鑒定出24種腸毒素，其中包含18種可產(chǎn)生催吐作用的腸毒素（SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEG、SEH、SEI、SEK、SEL、SEM、SEN、SEO、SEP、SEQ、SER、SES、SET）和5種尚待證實可產(chǎn)生催吐作用的SEls（SElJ、SElU2、SElV、SElX、SElY）[7]。編碼不同的腸毒素是由不同的流動遺傳元件如噬菌體、質(zhì)粒、致病島（Staphylococcus aureuspathogenicity island，SaPI）、腸毒素基因簇（enterotoxingene cluster，EGC）和葡萄球菌盒式染色體（staphylococcal cassettechromosome，SCC）等攜帶和傳播的。由攜帶經(jīng)典腸毒素基因（sea、seb、sec、sed、see）的金黃色葡萄球菌引起的食物中毒比例高達95%[8]。同時也有文獻表明，近年來越來越多不同類別食物中有新型腸毒素基因seg、seh、sei、sej檢出[9]。

金黃色葡萄球菌污染的食物主要以富含蛋白質(zhì)食物為主，如火腿、生鮮肉、加工后的紅肉、金槍魚、三明治餡料、蛋、乳及其制品以及奶油烘焙產(chǎn)品等[10]。而雞肉制品因肉嫩味鮮、蛋白質(zhì)豐富、熱量低，深受人們的喜愛，但在加工制作環(huán)節(jié)中極易受食源性病原菌的污染。2017～2018年，在對成都市部分學校食堂、養(yǎng)殖場及屠宰場采集的雞肉樣本檢測時發(fā)現(xiàn)，加工環(huán)節(jié)中的生肉類產(chǎn)品污染最嚴重，金黃色葡萄球菌檢出率高達54.2%[3]。國內(nèi)外研究也證實，在不同時期、區(qū)域、生產(chǎn)環(huán)節(jié)采集樣品后，發(fā)現(xiàn)雞肉產(chǎn)品中金黃色葡萄球菌的污染率在亞洲國家所有食品中是最高的[11]，雞肉切分車間中的不同傳送帶（腿、翅、架）、刀具、案板的黃色葡萄球菌數(shù)量分別可達到4.10、3.64、3.87、2.65、3.461（CFU/cm2）[12]，若食用了攜帶金黃色葡萄球菌的雞肉制品，將會帶來極大的安全隱患。

抗生素可以抑制細菌的生長，在臨床治療得到了很廣泛的應用。但是，抗生素的濫用導致多重耐藥菌株（multi-drug resistamt bacteria，MDR）出現(xiàn)[13]。特別是近年來出現(xiàn)的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistantstaphylococcusaureus，MRSA）菌株，因攜帶編碼新特異性青霉素結合蛋白（PBP2a）的mecA基因，幾乎對所有的β-內(nèi)酰胺類抗生素都表現(xiàn)出抗性[14]。因此，金黃色葡萄球菌成為國內(nèi)外研究者關注的重要致病性菌株，并通過脈沖場凝膠電泳法（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）、多位點序列分型法（multilocus sequence typing，MLST）和金黃色葡萄球菌蛋白A分型法（staphylococal protein A，SPA）等分子分型方法對該菌株進行流行病學研究。其中MLST是在多位點酶切電泳技術的基礎上發(fā)展起來的一種基因分型方法，重復性好，簡便易行，建有大型數(shù)據(jù)庫國際網(wǎng)站，便于在全球監(jiān)測和調(diào)查金黃色葡萄球菌傳播與溯源[15]。

目前，我國關于雞肉制品企業(yè)生產(chǎn)鏈上金黃色葡萄球菌污染情況的研究相對很少，由該菌引起的食品安全事件的菌源追溯及菌源控制也就缺乏相應的依據(jù)。雞肉制品生產(chǎn)過程，一般先經(jīng)過屠宰車間，然后進入切分車間進行凈膛、二級清洗預冷消毒、切分腿、翅、胸、皮，然后心、肝、頭、脖、爪、雞架等副產(chǎn)品進入副產(chǎn)品車間。進入屠宰車間的雞本身攜帶大量病原菌，同時切分車間的生產(chǎn)工人、工具、設備、空氣、預冷水及生產(chǎn)用水之間的交叉污染也會增加雞肉制品的污染水平。有研究證實，切分車間是金黃色葡萄球菌污染雞肉制品的主要途徑之一[16]。本研究以陜西省某地區(qū)雞肉制品加工廠為采樣點，對肉表面和雞肉加工過程所處環(huán)境進行采樣，通過對金黃色葡萄球菌檢測陽性樣本進行腸毒素基因檢測、MLST分型及耐藥性分析，確定金黃色葡萄球菌污染的關鍵環(huán)節(jié)及菌株特征，從而為有效防止雞肉加工過程中金黃色葡萄球菌污染和我國雞肉加工企業(yè)在加工過程中的安全控制與菌源追蹤提供科學依據(jù)及理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金黃色葡萄球菌的標準菌株（ATCC6538、ATCC25923） 西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院健康食品制造與安全實驗室提供；細菌DNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司；聚合酶鏈式反 應（polymerase chain reaction，PCR）用 Taq DNA聚 合 酶、10×PCR buffer、dNTPs、Mg2＋、DL2000 DNA Marker和引物 北京康為生物有限公司；氯霉素、青霉素G、環(huán)丙沙星、克林霉素、磺胺甲惡唑、四環(huán)素、慶大霉素、萬古霉素、利福平 北京索萊寶科技有限公司；其他化學試劑 均為分析純，國藥集團上?；瘜W試劑有限公司。

CFX96 PCR基因擴增儀 美國Bio-rad公司；GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-rad公司；Cary 60紫外分光光度計 美國安捷倫公司；BSC-1000生物安全柜 蘇州凈化設備有限公司；DW-86L490超低溫冰箱 海爾公司；ULUP超純水機 四川優(yōu)普超純科技術有限公司；5418R臺式離心機 德國Eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 金黃色葡萄球菌菌株的分離與鑒定 準備若干滅菌棉拭子，從陜西省某地區(qū)雞肉制品加工廠采集樣品，采集部位包括加工環(huán)節(jié)的肉表面（燙洗煺毛、清洗預冷、凈膛、分割、成品）和環(huán)境部位（燙毛機、刀具、內(nèi)臟、預冷池水、傳送帶、操作工人手部），共計260份，根據(jù)《食品安全國家標準-食品微生物學檢驗-金黃色葡萄球菌檢驗》（GB4789.10-2016）的發(fā)布方法對樣品進行預處理、增菌、分離、初步及確證鑒定。

1.2.2 基因組DNA的提取 根據(jù)細菌DNA提取試劑盒的操作說明書，提取金黃色葡萄球菌基因組DNA，將提取好的DNA保存于-20 ℃冰箱，待后續(xù)試驗使用。

1.2.3 PCR檢測腸毒素基因 選擇sea、seb、sec、sed、see、seg、seh、sei、sej9種腸毒素基因進行PCR檢測。根據(jù)相關文獻和檢索[4-5,10]，得到金黃色葡萄球菌腸毒素基因引物序列（表1）。PCR反應體系共20 μL，其中：ddH2O 7.4 μL、2×Taq PCR Master Mix 10 μL、上游引物和下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，DNA提取物1 μL。PCR程序運行參數(shù)：95 ℃，5 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，1 min，共進行35次循環(huán)；72 ℃，10 min。PCR反應片段長度與退火溫度如表1所示，在PCR基因擴增儀中進行，反應結束后冷卻至4 ℃。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果，并在凝膠成像系統(tǒng)中捕獲圖像。

1.2.4 多位點序列（MLST）分型 金黃色葡萄球菌的7個管家基因分別是arcC（編碼氨基甲酸酯激酶，456 bp）、aroE（編碼苯草酸脫氫酶，456 bp）、glpF（編碼甘油激酶，465 bp）、gmk（編碼鳥苷酸激酶，429 bp）、pta（編碼磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶，474 bp）、tpi（編碼磷酸丙糖異構酶，402 bp）、yqiL（編碼乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶，516 bp）。通過PCR擴增上述7個管家基因，并對PCR產(chǎn)物進行測序，測序由廣州賽默飛世爾科技公司完成。所獲擴增序列先在pubmlst網(wǎng)站（https://pubmlst.org）進行比對分析，獲得對應的基因序列號；再將得到7個基因序列號通過Search by combinations of MLST alleles進行比對，如菌株等位基因號的排列和公共數(shù)據(jù)庫匹配上，即可得到菌株的ST型；如菌株由于等位基因序號的排列和公共數(shù)據(jù)庫未匹配上，即可獲得新的ST型。

1.2.5 耐藥性測定 選擇氯霉素、青霉素G、環(huán)丙沙星、克林霉素、磺胺甲惡唑、四環(huán)素、慶大霉素、萬古霉素、利福平等9種抗生素，藥敏試驗采用K-B紙片擴散法，參考美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI）文件（2018 版）進行[11]。于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中震蕩培養(yǎng)（150 r/min）6 h，測定OD600的值，并調(diào)節(jié)其至0.5，取100 μL金黃色葡萄球菌菌液涂布于BHI固體培養(yǎng)基，貼上100 μg抗生素紙片，每個平板上均分三等份，貼三種不同的抗生素片，對分離菌株進行藥敏分析，對3種及以上抗生素同時耐藥即為多重耐藥菌株。

表1 九種腸毒素基因的PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences of nine enterotoxin genes

表2 金黃色葡萄球菌腸毒素基因分布情況Table 2 Distributions of enterotoxin gene from Staphylococcus aureus

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2007進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，并且使用word 2003進行三線表的繪制，采用Origin8.0進行柱狀圖的繪制工作。

2 結果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌分離菌株腸毒素基因檢出及分布情況

本研究針對所采集的260份樣本進行金黃色葡萄球菌的分離檢測，其中38份呈陽性，檢出率為14.62%。金黃色葡萄球菌腸毒素包含經(jīng)典腸毒素基因與新型腸毒素基因，本研究選擇5種經(jīng)典腸毒素基因（sea、seb、sec、sed和see）與4種型新腸毒素基因（seg、seh、sei、sej）進行PCR檢測，確定其在38株金黃色葡萄球菌中的檢出及分布情況。腸毒素基因分布情況見表2、圖1。

圖1 兩種及兩種以上金黃色葡萄球菌腸毒素基因分布情況Fig.1 Distributions of two or more enterotoxin genes from Staphylococcus aureus

在被檢測的38株金黃色葡萄球菌里，24株檢出含有腸毒素基因，腸毒素基因檢出率為63.16%。共檢測到7種毒素基因型，其中sed檢出率最高，有23株（60.53%），而新型腸毒素基因則是seg檢出率最高，有10株，約占26.32%。其中，攜帶有兩種以上腸毒素基因的菌株為14株（36.84%），有6株同時含有4種腸毒素基因（15.79%）。

2.2 金黃色葡萄球菌分離菌株的MLST分型分布

MLST結果見表3。在24株帶有腸毒素的金黃色葡萄球菌分離株中，有16株菌為ST7型菌株，其次為5株ST5和3株ST464型菌株。

表3 金黃色葡萄球菌分離菌株MLST分型檢測結果Table 3 The ST of Staphylococcus aureus strain with enterotoxin

2.3 金黃色葡萄球菌分離菌株耐藥性分布

采用氯霉素、青霉素G、環(huán)丙沙星、克林霉素、磺胺甲惡唑、四環(huán)素、慶大霉素、萬古霉素、利福平等9種抗生素對260份樣本檢測出的38株金黃色葡萄球菌進行藥敏分析，耐藥率見表4，多重耐藥譜見圖2。

由表4可知，38株分離菌株均對萬古霉素敏感，對青霉素G、環(huán)丙沙星、克林霉素、四環(huán)素的耐藥率較高，分別為86.84%（33/38）、60.53%（23/38）、55.26%（21/38）和52.63%（20/38），均已超過50%；其他依次是磺胺甲惡唑44.74%（17/38）、慶大霉素26.32%（10/38）、氯霉素23.68%（9/38）、利福平5.26%（2/38）；抑菌效果最好的抗生素是萬古霉素、利福平、慶大霉素、氯霉素。由圖2可以看出，對3種抗生素耐藥的金黃色葡萄球菌有7株，占18.42%，對4種抗生素耐藥的金黃色葡萄球菌有6株，占15.79%；對5種抗生素耐藥的金黃色葡萄球菌有9株，占23.68%；對6種抗生素耐藥的金黃色葡萄球菌有3株，占7.89%；多重耐藥率（≥3種抗生素）達65.78%。

表4 金黃色葡萄球菌分離菌株藥敏分析結果Table 4 Results of drug susceptibility analysis of isolated strains from Staphylococcus aureus

圖2 金黃色葡萄球菌分離菌株多重耐藥譜Fig.2 Multiple resistance spectrum of isolated strains from Staphylococcus aureus

3 討論與結論

本研究對雞肉加工環(huán)節(jié)進行采樣（包括肉表面和加工環(huán)境），采集了260份樣品，結果顯示38份樣品中檢測出金黃色葡萄球菌，檢出率為14.61%，而國內(nèi)近期文獻報道檢出率為16.51%、46%、23.4%、24.2%[17-20]，由此可見，國內(nèi)取樣基本上是市場上的鮮、凍雞肉，在流通、銷售過程中會存在二次污染。選擇sea、seb、sec、sed、see、seg、seh、sei、sej9種腸毒素基因進行PCR檢測，有24株被檢出含有腸毒素基因，腸毒素基因檢出率為63.16%。共檢測到7種毒素基因型，其中經(jīng)典腸毒素基因檢測出4種，sed為 60.53%，see為 21.05%，sec為 10.53%，sea為7.89%，已知文獻報道也檢測出了相關腸毒素基因[21]。盡管經(jīng)典腸毒素基因被認為是食物中毒的主要病因，但本研究還檢測出3種新型腸毒素基因，其中seg檢出率為26.32%，sei為18.42%；腸毒素具有遺傳多樣性與相關性，seg與seb、sec結構相似（氨基酸同一性為38%～42%），sei與sea、see、sed結構相似（氨基酸同一性為26%～28%），這兩個腸毒素基因在腸毒素基因間的系統(tǒng)發(fā)育上起重要作用，但目前尚不完全了解這些新型腸毒素與食物中毒之間的聯(lián)系[22-23]。因此，有必要加強雞肉制品中seg、sei的檢測，注意其攜帶率趨勢的變化，加強其致毒機理及遺傳相關性的研究，以防止食物中毒的發(fā)生。

MLST分型是一種被廣泛接受的基于DNA序列的分型方法，7個管家基因可以提供獨特的等位基因譜作為序列類型，獲得的數(shù)據(jù)具有很高的可重復性，適合用于長期的監(jiān)測菌群結構變化，研究地域性傳播和流行性變遷。對24株帶有腸毒素金黃色葡萄球菌進行MLST分型后顯示，16個菌株為ST7型，5個菌株為ST5型，3個菌株為ST464型。我國對雞肉制品的生產(chǎn)過程的研究較少，對比國外結果，美國研究者在雞和火雞中所攜帶的金黃色葡萄球菌中鑒定出ST5和ST398兩種序列型[24]；比利時研究者在活雞中檢測出ST398[25]；而國內(nèi)主要是對引起食源性中毒的金黃色葡萄球菌進行MLST分型，目前鑒定出的序列型主要是ST1、ST5、ST6、ST7、ST9、ST15、ST30、ST59、ST72、ST88、ST97、ST338、ST398、ST464、ST804、ST1003[26]。本研究結得到ST5、ST7、ST464的序列型符合目前國內(nèi)鑒定得到的序列型，衛(wèi)沛楠從石家莊地區(qū)食物中毒樣品中分離得到的金黃色葡萄球菌，進行MLST分型，ST5序列型有5株、ST7序列型有2株、ST464序列型有3株[27]；顏文光從揚州市農(nóng)貿(mào)市場和超市食物中分離得到的金黃色葡萄球菌存在5株ST7型[28]。

近年來由于抗生素大量應用于畜牧業(yè)的生產(chǎn)，導致金黃色葡萄球菌對抗生素耐藥性不斷提高。自從1996年第1例耐藥性金黃色葡萄球菌報道以來，在肉類、乳類、水產(chǎn)品等動物源食品或包含動物源的食品都檢測出耐藥性金黃色葡萄球菌菌株[29-31]。1995～2005年，美國廣泛將氟喹諾酮類藥物用于肉雞生產(chǎn)中，導致耐氟喹諾酮類金黃色葡萄球菌流行[24]。本研究選擇氯霉素、青霉素G、環(huán)丙沙星、克林霉素、磺胺甲惡唑、四環(huán)素、慶大霉素、萬古霉素、利福平等9種抗生素對分離菌株進行藥敏分析，發(fā)現(xiàn)38株金黃色葡萄球菌分離菌株均對萬古霉素敏感，這與相關文獻報道一致[32]，說明萬古霉素是目前用來對付金黃色葡萄球菌感染的最強有力抗生素藥物。本研究還發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌對青霉素G、環(huán)丙沙星、克林霉素、四環(huán)素的耐藥率較高，與國內(nèi)外文獻相比，既有一致性，又有一定差異。如Waters等報道，雞肉中金黃色葡萄球菌普遍對喹諾酮類、四環(huán)素、氨芐青霉素、青霉素、紅霉素具有耐藥性[24]；徐本錦等研究發(fā)現(xiàn)，雞肉中金黃色葡萄球菌對紅霉素、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑、四環(huán)素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、苯唑西林、阿莫西林的耐藥性較高[32]；宋康研究發(fā)現(xiàn)，雞肉中金黃色葡萄球菌對四環(huán)素、紅霉素、氟哌酸、復方新諾明、桿菌肽、鏈霉素、羅紅霉素具有耐藥性[33]；Lin等研究發(fā)現(xiàn)，雞肉中金黃色葡萄球菌對克林霉素、四環(huán)素、氯霉素，紅霉素、泰樂菌素的耐藥性非常普遍[34]；以上學者研究中，從雞肉中分離出的金黃色葡萄球菌普遍對四環(huán)素、青霉素等常見的抗生素具有耐藥性，但也存在只對特定抗生素存在耐藥性的情況，如Sarah等研究證實，來自雞屠宰場金黃色葡萄球菌分離株僅對β-內(nèi)酰胺類和氟喹諾酮類耐藥[35]?？傮w來看，各類研究均發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌普遍對β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氟喹諾酮類藥物具有耐藥性，但不同研究有一定差異，出現(xiàn)上述差異原因可能與肉雞飼養(yǎng)環(huán)境及生長過程中抗生素的使用種類有關。

本研究從雞肉制品中分離得到的攜帶毒素基因的金黃色葡萄球菌中，其MLST分型都為ST序列型，且均對萬古霉素有耐藥性，ST464與ST7型菌株多重耐藥性相對較高，如3個ST464型菌株分別對4～6種抗生素具有耐藥性；幾乎所有ST7型菌株均對3種及以上抗生素具有耐藥性，但不同菌株耐藥性沒有一定規(guī)律性。ST464型菌株主要含有sea、sed、see腸毒素基因，ST7型普遍含有sed腸毒素基因，由此可以推斷含有sed基因的菌株有可能是引起金黃色葡萄球菌多重耐藥性的主要因素。以往的研究證實，金黃色葡萄球菌之所以存在耐藥性是由于其含有耐藥基因，耐藥基因有的位于質(zhì)粒上，有的位于染色體上，前者居多，耐藥基因位于質(zhì)粒上比定位于染色體上更易使抗藥性傳播[27]?；谀壳暗臄?shù)據(jù)可以推測，sed基因與耐藥基因有可能同樣位于質(zhì)粒上，從而產(chǎn)生菌株的多重耐藥性，具體原因還有待于進一步研究證實。

雞肉制品生產(chǎn)過程中會存在金黃色葡萄球菌污染的情況，本研究從雞肉加工環(huán)境中的260份樣品中檢測到出38株金黃色葡萄球菌分離菌株，這些菌株中有24株（63.16%）都攜帶了毒素基因，且攜帶毒素基因菌種的MLST分型都為ST型，其中ST7型菌株最多。有超過一半的菌株都對抗生素敏感，其中抑菌效果最好的抗生素是萬古霉素，有25株（65.78%）存在著多重耐藥性。因此，應加強雞肉制品生產(chǎn)的監(jiān)管，重視細菌耐藥性監(jiān)測，避免相關耐藥菌株的出現(xiàn)，加強雞肉產(chǎn)品生產(chǎn)過程中關鍵污染環(huán)節(jié)控制，加強對加工操作人員的規(guī)范管理和監(jiān)督，確保食品與公共衛(wèi)生安全。