王 娟，姜忠玲，叢 霞，曹榮峰，田文儒，豐艷妮，李華濤

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266109)

鈣是奶牛體內(nèi)不可或缺的常量無(wú)機(jī)元素，參與體內(nèi)多種生理過(guò)程[1]，如凝血、骨生成[2]、肌肉收縮、神經(jīng)傳導(dǎo)以及能量代謝[3]等，并發(fā)揮著十分重要的作用。當(dāng)奶牛受到各種因素的影響，致使其體內(nèi)的鈣濃度變化超出自身的調(diào)節(jié)范圍時(shí)，就會(huì)引起鈣代謝紊亂。尤其是圍產(chǎn)期奶牛因妊娠和泌乳導(dǎo)致鈣大量流失[4]，極易引發(fā)低鈣血癥。目前，臨床上對(duì)奶牛圍產(chǎn)期低鈣血癥的檢測(cè)多依賴(lài)于血清生化指標(biāo)，但由于個(gè)體差異的原因，不同奶牛對(duì)血鈣濃度變化范圍耐受程度不同，血清生化指標(biāo)并不能準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)低鈣血癥的發(fā)生與發(fā)展，也無(wú)法準(zhǔn)確判定亞臨床型低鈣血癥。因此，找出更為靈敏且精準(zhǔn)判定奶牛圍產(chǎn)期低鈣血癥的生物標(biāo)志物將有重要的應(yīng)用價(jià)值。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA sequencing,RNA-seq)技術(shù)作為一種新興技術(shù)被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，其測(cè)序結(jié)果也在后續(xù)研究中相繼被證實(shí)。雖然目前RNA-seq技術(shù)仍存在一些不足，但其具有篩選范圍廣、精度高、成本低、無(wú)損檢測(cè)等特點(diǎn)，仍是臨床發(fā)掘疾病生物標(biāo)志物不可取代的手段。

本研究擬篩選低鈣培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞(Cow mammary epithelial cells, CMEC)差異表達(dá)基因，為臨床尋找更為準(zhǔn)確、靈敏的奶牛低鈣血癥生物標(biāo)志物提供方法與思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源及處置 本實(shí)驗(yàn)室凍存的自行培養(yǎng)并且已經(jīng)鑒定的CMEC細(xì)胞系，將細(xì)胞分為低鈣培養(yǎng)組(DE)及空白對(duì)照組(DP)，提取總RNA后用于后續(xù)試驗(yàn)。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)(qRT-PCR)驗(yàn)證每組，設(shè)9個(gè)重復(fù)。

1.2 試劑 TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DL2 000 DNA marker、TB GreenTMpremix ExTMTaqⅡ熒光染料，均購(gòu)自TaKaRa公司；焦碳酸二乙酯(Diethyl pyrocarbonate，DEPC)、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸[Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, EGTA]、青鏈霉素混合液(雙抗，100×)、50×TAE緩沖液,均購(gòu)自Solarbio公司；D-MEM/F-12培養(yǎng)基，購(gòu)自Gibco公司(使用時(shí)添加10%胎牛血清和1%雙抗)；胎牛血清，購(gòu)自ExCell Bio公司；鈣試劑盒(微板法)及CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物研究所；PBS緩沖液用DEPC處理過(guò)的水配制；EASY spin組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒，購(gòu)自艾德萊生物有限公司；Kadaq 2×PCR Master Mix，購(gòu)自Abm公司；引物由青島派諾森基因科技有限公司合成；其余未特別指明的生化試劑，均購(gòu)自Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 依他酸(EGTA)濃度篩選及CMEC低鈣培養(yǎng) 將經(jīng)復(fù)蘇后培養(yǎng)的CMEC隨機(jī)分為空白對(duì)照(DP)、0.5 mmol/L EGTA(DE1)、1.0 mmol/L EGTA(DE2)和2.0 mmol/L EGTA(DE3)組，分別培養(yǎng)24、48 h和72 h后鏡檢觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，并用Toup View軟件拍照記錄。按照鈣試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)4個(gè)分組的培養(yǎng)基進(jìn)行Ca2+濃度測(cè)定。按照CCK-8檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)分別于培養(yǎng)后24～144 h檢測(cè)細(xì)胞活力(每隔24 h檢測(cè)1次)，以造成細(xì)胞生長(zhǎng)明顯抑制且不造成細(xì)胞大量凋亡為標(biāo)準(zhǔn)選擇低鈣培養(yǎng)濃度。

1.3.2 CMEC的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及數(shù)據(jù)分析 選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞量>5×106個(gè)的DP組和DE2組CMEC，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入1 mL TRIzol試劑反復(fù)吹打，至溶液澄清度均一后，移入凍存管中，分別標(biāo)記為DP和DE，密封后于-80 ℃保存，將制備好的樣品保存于干冰中送公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。將測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)經(jīng)堿基識(shí)別分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列(Raw reads)，過(guò)濾后得到Clean reads，后續(xù)的數(shù)據(jù)分析都基于Clean reads。將Clean reads與參考基因組的序列進(jìn)行對(duì)比，得到基因的表達(dá)量，經(jīng)分析后獲得差異表達(dá)基因。最后對(duì)基因功能進(jìn)行注釋及GO、京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)分析。

1.3.3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的qRT-PCR驗(yàn)證

1.3.3.1 測(cè)序樣品制備 按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)從低鈣組及對(duì)照組細(xì)胞中提取總RNA。用Eppendrof 蛋白質(zhì)核酸定量?jī)x檢測(cè)提取的總RNA濃度，A260/A280和A260/A230值均在2.0以上時(shí)可用于后續(xù)試驗(yàn)。將提取的總RNA于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 引物合成 使用牛β-actin為參考基因，從測(cè)序結(jié)果中篩選8個(gè)差異表達(dá)顯著性基因，參照美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)公布的基因序列，采用NCBI官網(wǎng)的Primer-BLAST進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR驗(yàn)證基因的引物序列Table 1 Primers used for qRT-PCR in the study

1.3.3.3 反轉(zhuǎn)錄及核酸電泳驗(yàn)證 按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)配制10 μL gDNA去除體系，根據(jù)RNA提取濃度，保證體系中含有1 μg RNA，震蕩混勻后離心5～10 s，于42 ℃孵育2 min。配制反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增體系，加入gDNA去除后的RNA，漩渦混勻、離心后，于PCR儀中37 ℃孵育15 min、85 ℃孵育5 s 后得到cDNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。使用?actin引物，配制10 μL PCR擴(kuò)增體系，對(duì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共29個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸7 min，最后4 ℃孵育。核酸電泳對(duì)擴(kuò)增的cDNA進(jìn)行驗(yàn)證，每組設(shè)9個(gè)重復(fù)。電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)下進(jìn)行觀察并保存圖像。

1.3.3.4 qRT-PCR驗(yàn)證 配制20 μL qRT-PCR擴(kuò)增體系，按照Light Cycler?96 SW熒光定量PCR儀操作說(shuō)明書(shū)，對(duì)所選8個(gè)差異基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。以β-actin為參考基因，采用2-ΔΔCt方法對(duì)所測(cè)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)情況進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用GraphPad Prism 5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間采用單因素方差分析，計(jì)算Log2FC值后與RNA-seq測(cè)序結(jié)果進(jìn)行差異倍數(shù)比較。

2 結(jié)果

2.1 EGTA濃度篩選及CMEC低鈣培養(yǎng) 采用不同Ca2+濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞24 h后，DE1、DE2組與DP組間無(wú)明顯差異，而DE3組明顯可見(jiàn)大量細(xì)胞皺縮成圓形亮點(diǎn)，細(xì)胞質(zhì)空泡化，核質(zhì)凝縮。培養(yǎng)48 h及72 h后，DE1組較DP組無(wú)明顯肉眼可見(jiàn)變化，DE2組細(xì)胞較DP組細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，并有少量細(xì)胞凋亡，DE3組細(xì)胞開(kāi)始大量凋亡脫落(中插彩版圖1)。

圖1 不同Ca2+濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)后24、48 h和72 h的奶牛乳腺上皮細(xì)胞 (40×)Fig.1 Bovine mammary epithelial cells cultured within different concentrations of Ca2+ for 24, 48 h and 72 h

采用鈣試劑盒分別對(duì)DP、DE1、DE2組和DE3組培養(yǎng)基進(jìn)行Ca2+濃度檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，4個(gè)組鈣離子濃度分別為1.02、0.87、0.43 mmol/L和0.03 mmol/L。CCK-8結(jié)果顯示，與DP組相比，DE1、DE2、DE3組對(duì)CMEC的生長(zhǎng)均有抑制作用，DE1組與DE2組細(xì)胞在48 h存活率明顯上升，72 h存活率下降，之后逐漸趨于平穩(wěn)(圖2)。DE3組細(xì)胞的生長(zhǎng)受到顯著抑制，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞逐漸凋亡。據(jù)此，將選取DE2組細(xì)胞培養(yǎng)72 h后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 不同Ca2+濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)后奶牛乳腺上皮細(xì)胞存活率Fig.2 Effects of different concentrations of Ca2+ on survival rate of bovine mammary epithelial cells

2.2 CMEC的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

2.2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析 根據(jù)DP組和DE組的堿基質(zhì)量分?jǐn)?shù)和堿基質(zhì)量分布，不論是正向測(cè)序還是反向測(cè)序，其堿基質(zhì)量分?jǐn)?shù)90%以上集中于30%～40%，說(shuō)明其錯(cuò)誤率控制在0.1%～0.01%。DP組和DE組的GC含量大多集中在40%～50%，說(shuō)明在建庫(kù)過(guò)程中序列是隨機(jī)打斷的且測(cè)序文庫(kù)的質(zhì)量良好。通過(guò)Hisat 2軟件將所測(cè)序列與參考基因組Bos taurus進(jìn)行比對(duì)，其比對(duì)率均達(dá)96%以上(表2)，說(shuō)明所選參考基因組合適，且樣品可滿(mǎn)足后續(xù)分析的需求。

表2 參考基因組比對(duì)統(tǒng)計(jì)分析Table 2 Statistical analysis of comparison with reference genome

2.2.2 差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)分析 以差異倍數(shù)∣log2(Fold change,FC)∣≥1 及顯著水平P<0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)篩選DE組與DP組之間的差異表達(dá)基因，共計(jì)得到顯著差異表達(dá)基因116個(gè)，其中52個(gè)表達(dá)上調(diào)基因，64個(gè)表達(dá)下調(diào)基因(見(jiàn)中插彩版圖3A)。對(duì)2組的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，發(fā)現(xiàn)其主要集中于三大類(lèi)30個(gè)小類(lèi)中，主要參與了染色質(zhì)構(gòu)型、細(xì)胞內(nèi)組成、染色質(zhì)結(jié)合等(中插彩版圖3B)。差異表達(dá)基因大多富集于硫代謝、硫中繼系統(tǒng)、病毒致癌作用、半胱氨酸和蛋氨酸代謝等信號(hào)通路(中插彩版圖3C)，根據(jù)富集結(jié)果，以與鈣平衡調(diào)節(jié)相關(guān)的甲狀腺素信號(hào)通路和甲狀腺素合成通路為例，查找到差異表達(dá)上調(diào)基因KAT2A和差異表達(dá)下調(diào)基因DUOXA2。甲狀腺素相關(guān)通路對(duì)機(jī)體鈣水平調(diào)節(jié)具有重要意義，該差異基因可能與細(xì)胞受低鈣環(huán)境培養(yǎng)有關(guān)。

圖3 兩組間差異表達(dá)基因分析Fig.3 Analysis of differentially expressed genes between the two groupsA:火山圖，圖中一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)基因，紅點(diǎn)為上調(diào)基因，藍(lán)點(diǎn)為下調(diào)基因；B:GO富集分析圖; C:KEGG通路富集分析圖，圖中點(diǎn)越大代表所富集的基因數(shù)量越多，顏色越深代表P值越小A: Volcano plot, a dot in the diagram represents a gene, red dot represents up-regulated gene, blue dot represents down-regulated gene;B: GO enrichment analysis diagram; C: KEGG pathway enrichment analysis diagram. The larger the dot in the picture, the more genes are enriched. The darker color, the lower P value.

2.3 CMEC轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的qRT-PCR驗(yàn)證

2.3.1 樣品的qRT-PCR檢測(cè) 經(jīng)蛋白質(zhì)核酸定量檢測(cè)儀檢測(cè)，提取的DP組和DE組總RNA濃度均在440 ng/μL以上，且A260/A280、A260/A230值均>2.0，提取質(zhì)量?jī)?yōu)良。以參考基因β-actin為引物進(jìn)行cDNA的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，核酸電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果可得，產(chǎn)物均在250 bp左右，可初步判斷產(chǎn)物為β-actin片段。2組及其重復(fù)均可見(jiàn)較亮的條帶(圖4)，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖4 cDNA擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Amplification results of cDNAM：DL-2 000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； DP-W：空白對(duì)照； DE-W：低鈣培養(yǎng)組M: DL-2 000 DNA marker; DP-W: Blank control; DE-W: Low calcium medium group

2.3.2 篩選基因的qRT-PCR驗(yàn)證 將qRT-PCR結(jié)果經(jīng)計(jì)算后與RNA-seq測(cè)序結(jié)果的差異倍數(shù)Log2FC進(jìn)行比較，7個(gè)基因與RNA-seq測(cè)序結(jié)果相符，有1個(gè) 基因與測(cè)序結(jié)果不符(圖5)。說(shuō)明RNA-seq測(cè)序結(jié)果較為可靠，準(zhǔn)確性較高。

圖5 RNA-seq與qRT-PCR差異倍數(shù)比較Fig.5 Comparison of differential multiples between RNA-seq and qRT-PCR

3 討論

圍產(chǎn)期低鈣血癥是奶牛常見(jiàn)的鈣代謝紊亂性疾病，處于低鈣血癥狀態(tài)的奶牛常因免疫力低下而誘發(fā)子宮復(fù)舊不全、子宮內(nèi)膜炎、胎衣不下、乳房炎[5-8]和真胃變位[8]，同時(shí)還會(huì)影響奶牛的生產(chǎn)性能[9-12]，對(duì)于分娩后的奶牛來(lái)說(shuō)，大量的鈣隨乳汁流逝更易引發(fā)低鈣血癥。泌乳期CMEC在調(diào)節(jié)鈣的轉(zhuǎn)運(yùn)以及維持胞內(nèi)鈣平衡等方面起重要作用[13]，但其具體機(jī)制尚不明確。目前，已有研究人員利用RNA-seq技術(shù)對(duì)動(dòng)物[14]、植物[15-16]等在遭受外界刺激后的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，從而發(fā)現(xiàn)了相關(guān)差異表達(dá)基因，為動(dòng)物、植物遭受外界應(yīng)激后相關(guān)分子機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。人醫(yī)中也有利用該技術(shù)用于疾病診斷[17]以及尋找疾病生物標(biāo)志物的相關(guān)報(bào)道[18-20]。對(duì)于低鈣血癥的檢測(cè)臨床多依賴(lài)于血清生化指標(biāo)，但取血時(shí)操作不當(dāng)易引發(fā)應(yīng)激、細(xì)菌感染等問(wèn)題，十分不便。故本研究選用CMEC為研究對(duì)象，利用RNA-seq技術(shù)研究低鈣培養(yǎng)對(duì)CMEC基因表達(dá)水平的影響，篩選差異表達(dá)基因，以研究該細(xì)胞應(yīng)對(duì)低鈣環(huán)境的分子機(jī)制，以期尋找到可經(jīng)乳汁中乳腺上皮細(xì)胞檢測(cè)圍產(chǎn)期奶牛低鈣血癥的生物標(biāo)志物。

經(jīng)差異表達(dá)基因GO富集分析及KEGG通路分析顯示，低鈣培養(yǎng)可影響細(xì)胞的基因表達(dá)，且2組間差異表達(dá)基因富集于多個(gè)通路之中，以與鈣調(diào)節(jié)相關(guān)的甲狀腺通路為例查找到富集基因KAT2A和DUOXA2。甲狀腺激素主要作用于骨骼，能夠調(diào)節(jié)骨骼的新陳代謝，影響骨骼的重建過(guò)程，促進(jìn)破骨細(xì)胞的活性發(fā)生改變，使骨吸收過(guò)程大于骨形成過(guò)程[21]，可通過(guò)增加尿液中的鈣含量和糞鈣的排出量來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體的鈣平衡。KAT2A和DUOXA2基因分別指導(dǎo)賴(lài)氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶和雙氧化酶成熟因子的合成。賴(lài)氨酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶是組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶的一種，其可作為轉(zhuǎn)錄激活因子將乙酰基從乙酰輔酶A中轉(zhuǎn)移到特定組蛋白氨基末端的賴(lài)氨酸上，使與該段結(jié)合的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)變疏松，利于轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。有研究表明，KAT2A基因可通過(guò)經(jīng)典Wnt通路調(diào)節(jié)牙周膜干細(xì)胞的成骨分化作用，且與之呈正相關(guān)，KAT2A表達(dá)水平降低可使細(xì)胞的成骨分化能力減弱，使牙齒骨量減少[22-23]。甲狀腺素是由TPO在H2O2的參與下經(jīng)催化碘的有機(jī)化、酪氨酸碘化以及碘化酪氨酸耦聯(lián)等過(guò)程生成的，雙氧化酶2與H2O2的生成有關(guān)，雙氧化酶成熟因子2則主要起協(xié)助雙氧化酶2蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、成熟以及定位的作用[24]。本研究中KAT2A和DUOXA2基因表達(dá)分別上、下調(diào)的結(jié)果說(shuō)明，低鈣環(huán)境下培養(yǎng)可能會(huì)影響細(xì)胞甲狀腺素的合成，致使甲狀腺素含量異常，影響骨的代謝過(guò)程[25]，進(jìn)而影響鈣水平的調(diào)節(jié)。因此，KAT2A和DUOXA2基因差異表達(dá)可能間接與該細(xì)胞應(yīng)對(duì)低鈣培養(yǎng)環(huán)境有關(guān)，這為尋找圍產(chǎn)期奶牛低鈣血癥生物標(biāo)志物提供了研究方向，但其具體參與機(jī)制和臨床應(yīng)用還需進(jìn)一步的研究。