羅遠(yuǎn)燕 , 陳心瑜 , 陳 鑫 , 杜倩笙 , 龐燕麗 , 勞承連 , 李 崇 , 王莉貞 , 司紅彬

(廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004)

大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coil)屬于革蘭陰性菌，廣泛存在于自然界，為人和動(dòng)物腸道中的常居菌，在一定條件下可引起仔豬黃、白痢和仔豬水腫病，同時(shí)可引起發(fā)病率和死亡率普遍較高的其他獸醫(yī)臨床常見病[1]。此外，致病性大腸桿菌主要以家畜、家禽及其制品為主要傳播載體，可引起食物中毒、胃腸炎等腸道疾病，甚至導(dǎo)致死亡[2]。在一些資源貧乏的環(huán)境中，如條件惡劣的養(yǎng)殖場(chǎng)等，由于過度擁擠、衛(wèi)生條件差、環(huán)境復(fù)雜，更加有助于多種抗藥性大腸桿菌的傳播[3]。近年來，隨著越來越多的抗菌藥物被廣泛使用，使得耐藥菌株不斷出現(xiàn)，菌株的耐藥譜也在不斷擴(kuò)大，加劇了抗菌藥物在畜禽體內(nèi)的殘留，導(dǎo)致動(dòng)物源性食品中大腸桿菌耐藥性的加劇[4]。

為了解廣西地區(qū)大腸桿菌對(duì)常用抗菌藥的耐藥情況及其所含耐藥基因型，本試驗(yàn)對(duì)廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院中獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定后甘油保藏的113株大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)和相關(guān)耐藥基因型的檢測(cè)，旨在為獸醫(yī)臨床大腸桿菌耐藥性研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 113株廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院中獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室在廣西區(qū)域內(nèi)分離鑒定后甘油保藏的大腸桿菌菌株。麥康凱瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)、伊紅美藍(lán)瓊脂，均購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。選用頭孢噻呋鈉、阿米卡星、阿莫西林、磺胺間甲氧嘧啶等 13 種臨床上常用的抗菌藥物，用蒸餾水稀釋至終濃度為6 400 μg/mL；氟苯尼考為5 120 μg/mL[5]；加替沙星為3 200 μg/mL。革蘭染液；TE緩沖液；TaqPCR Master Mix；DNA marker D；Regular Agarose G-10(BIOWEST)。

1.2 儀器與設(shè)備 GE9612T PCR擴(kuò)增儀，杭州柏恒科技有限公司；P25T電泳儀，Biometra公司；1600R凝膠成像儀， Tanon公司；5418R離心機(jī)，Eppdorf公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種復(fù)蘇 從甘油保藏菌種中吸取100 μL加入至3.5 mL NB肉湯試管當(dāng)中，放入恒溫培養(yǎng)振蕩器(37 ℃，220 r/min)生長(zhǎng)12 h。

1.3.2 大腸桿菌最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定 以2011年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI) 推薦的方法和結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，采用2倍微量稀釋法測(cè)定大腸桿菌對(duì)常用13種抗菌類藥物的最小抑菌濃度(Minimal inhibiton concertration，MIC)，13種抗菌類藥物包括：β-內(nèi)酰胺類：頭孢曲松鈉、頭孢他啶、頭孢噻呋鈉、阿莫西林、頭孢噻肟鈉、美羅培南；氟喹諾酮類：環(huán)丙沙星、加替沙星、左旋氧氟沙星；磺胺類：磺胺間甲氧嘧啶；氨基糖苷類：阿米卡星；氯霉素類：氟苯尼考；多磷類：磷霉素。其中，氟苯尼考的耐藥折點(diǎn)參考文獻(xiàn)[6]報(bào)道。

1.3.3 耐藥基因的檢測(cè) 用煮沸法[7]提取大腸桿菌DNA，將細(xì)菌接種于 NB 肉湯中，37 ℃振蕩培養(yǎng) 12～24 h，吸取2 mL于2 mL EP管內(nèi)，12 000 r/min離心3 min，去上清液，加入200 μL的TE緩沖液，沸水浴10 min后，12 000 r/min離心3 min取上清液分裝，放入4 ℃冰箱保存供試驗(yàn)使用。

PCR反應(yīng)體系(25 μL)：Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，超純水8.5 μL。PCR反應(yīng)條件：頂蓋溫度94 ℃，94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火(溫度如表1所示)30 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳45 min后，在紫外投射儀下觀察結(jié)果并用凝膠成像系統(tǒng)攝影。

表1 耐藥基因引物信息Table 1 The information of drug resistance gene primer

2 結(jié)果

2.1 大腸桿菌最小抑菌濃度(MIC) 如表2結(jié)果所示，在113株大腸桿菌中，MIC各濃度分布不盡相同。其中大腸桿菌對(duì)頭孢噻呋鈉及磺胺間甲氧嘧啶2種藥物的MIC主要集中在MIC≥3 200 μg/mL范圍內(nèi)，具體MIC≥3 200 μg/mL的細(xì)菌比例分別占92.6%和90.2%。然而，大腸桿菌對(duì)美羅培南的MIC分布主要集中在≤1.562 5 μg/mL，比例為96.46%(109/113)。另外根據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，其中對(duì)3種及3種以上藥物MIC≥3 200 μg/mL的菌株有42株， 占37.2%。

在113株菌中，耐藥情況各有差異，其中頭孢噻呋鈉及氟苯尼考的耐藥率最高，達(dá)99.1%。其次，磺胺間甲氧嘧啶、阿莫西林、環(huán)丙沙星、頭孢噻肟鈉、頭孢曲松鈉、左旋氧氟沙星、加替沙星、頭孢他啶、磷霉素的耐藥率較高，分別為93.5%、92.9%、91.1%、89.9%、73.4%、72.5%、69.4%、56.6%、50.5%。分離的菌株對(duì)于抗菌藥阿米卡星、美羅培南敏感，其耐藥率僅為32.7%、3.5%，結(jié)果見表2、表3。

大腸桿菌對(duì)氟苯尼考的MIC分布主要在640 μg/mL、 1 280 μg/mL、≥2 560 μg/mL這3個(gè)濃度，分別占29.2%(33/113)、32.74%(37/113)、28.31%(32/113)，總體對(duì)氟苯尼考的耐藥率為99.1%，見表3。

表3 大腸桿菌對(duì)氟苯尼考的最小抑菌濃度及耐藥率Table 3 The minimum inhibitory concentration and resistance rate of E. coli to florfenicol

2.2 大腸桿菌耐藥基因PCR擴(kuò)增結(jié)果 從試驗(yàn)菌株中選取對(duì)3種或3種以上藥物MIC≥3 200 μg/mL的42株細(xì)菌，采用PCR法分別檢測(cè)其blaTEM基因、blaCTX-M-9基因、sul2基因，試驗(yàn)陽性對(duì)照與陰性對(duì)照基本符合預(yù)期設(shè)計(jì)。

由表4可知，在選取的42株菌中，有23株檢測(cè)出含有耐藥基因，占53.4%(23/42)，已超過半數(shù)，本次試驗(yàn)檢出攜帶blaTEM基因、blaCTX-M-9基因、sul2基因分別為19.0%、38.1%、45.2%。

表4 耐藥基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 4 Statistics of PCR amplification results of drug resistance genes

3 討論

本藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)蘇培養(yǎng)的113株大腸桿菌對(duì)常見抗菌藥耐藥情況各不相同，但其耐藥情況總體趨于嚴(yán)重，主要體現(xiàn)在耐藥率和耐藥水平較高，細(xì)菌耐藥菌譜廣。其中，本試驗(yàn)復(fù)蘇大腸桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類耐藥率為69.2%，該結(jié)果比近年來福建地區(qū)高，但是略低于河南地區(qū)(超過70%)，與揚(yáng)州地區(qū)寵物源性大腸桿菌耐阿莫西林(59.73%)、頭孢曲松鈉(44.23%)、頭孢噻呋鈉(21.68%)[8]結(jié)果相比，本試驗(yàn)結(jié)果細(xì)菌耐藥率則普遍偏高，大腸桿菌對(duì)該類抗菌藥物耐藥性較強(qiáng)。另外，氯霉素類氟苯尼考耐藥率為99.1%，該結(jié)果高于河南地區(qū)>60%、福建地區(qū)73.7%、揚(yáng)州59.29%，表現(xiàn)為耐藥。細(xì)菌對(duì)磺胺類耐藥率為99.1%，其結(jié)果與廣州地區(qū)99.13%相近，略高于福建地區(qū)93.8%及河南地區(qū)94.6%，均表現(xiàn)較強(qiáng)的耐藥性[1,10]。對(duì)于氨基糖苷類藥物阿米卡星耐藥率為32.7%，則明顯低于秦皇島犢牛源大腸桿菌83.3%[11]。

在廣西地區(qū)，大腸桿菌對(duì)個(gè)別抗菌藥物存在較高的耐藥性，且耐藥率較穩(wěn)定，但對(duì)大部分抗菌藥物耐藥率明顯上升。其中β-內(nèi)酰胺類藥阿莫西林耐藥率(92.9%)，與馮世文等[12]2016年對(duì)廣西豬源致病性大腸桿菌耐藥性結(jié)果(97.1%)接近，而頭孢曲松鈉、阿米卡星的耐藥性與其3.9%、16.5%結(jié)果比較則呈明顯上升趨勢(shì)。氟苯尼考耐藥率與2009年謝永平等[13]對(duì)廣西地區(qū)豬源大腸桿菌耐藥性檢測(cè)結(jié)果17.8%對(duì)比，耐藥率明顯升高。

此外，大腸桿菌的耐藥基因檢出率偏高。目前在所檢測(cè)的42株菌中，sul2耐藥基因檢出率最高(45.2%)，與貴州地區(qū)(77.3%)相比檢出率偏低[14]，但是遠(yuǎn)高于西藏地區(qū)[15]牦牛源大腸桿菌(4.92%)。ESBLs基因(blaTEM和blaCTX-M-9)的檢出率為57.1%，其中blaTEM檢出率與廣州地區(qū)豬源大腸桿菌73.81%相比偏低[12]。

綜上所述，本試驗(yàn)從廣西地區(qū)分離的大腸桿菌菌株耐藥性及耐藥基因檢出率出發(fā)，與不同地區(qū)分離的大腸桿菌耐藥情況作比較。結(jié)果表明，不同地區(qū)分離大腸桿菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率均有所不同，就廣西地區(qū)而言，其大腸桿菌對(duì)常見抗菌藥物耐藥情況趨于嚴(yán)重，近年來耐藥率呈升高趨勢(shì)，ESBLs耐藥基因及磺胺類sul2耐藥基因檢出率偏高。從理論數(shù)據(jù)上看，對(duì)于廣西地區(qū)內(nèi)動(dòng)物大腸桿菌病的治療，使用磺胺類及β-內(nèi)酰胺類藥物效果不甚明顯。