楊元銘 李篤軍 王曉慧 劉入華 王斌 朱元祺

雷極普羅威登菌屬于腸桿菌目,是臨床上重要的條件致病菌,可引起兒童或成人的泌尿道、呼吸道、傷口、腦脊液或血流的感染［1,2］。由于該菌對(duì)替加環(huán)素和多粘菌素天然耐藥,一旦雷極普羅威登菌呈現(xiàn)產(chǎn)碳青霉烯酶,這將使臨床醫(yī)師對(duì)抗感染治療藥物的選擇面臨困難,甚至可能出現(xiàn)無(wú)藥可用的局面［3］。因此,本研究對(duì)分離自患兒腦脊液感染的耐碳青霉烯類雷極普羅威登菌QD51 臨床株利用PCR 和高通量測(cè)序?qū)ζ淠退帣C(jī)制進(jìn)行研究,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 耐碳青霉烯類雷極普羅威登菌臨床株QD51 于2014 年11 月分離自顱內(nèi)感染患兒的腦脊液標(biāo)本。電泳分子量標(biāo)記的沙門(mén)菌H9812、藥敏質(zhì)控菌株ATCC25922 和質(zhì)粒受體菌大腸埃希菌 J53AziR為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 細(xì)菌鑒定和藥敏采用法國(guó)生物梅里埃VITEK-2 Compact 系統(tǒng),藥敏判定標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)CLSI-2019［4］。美國(guó)BIO-RAD 公司的PCR 擴(kuò)增儀、脈沖場(chǎng)電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)。大連寶生生物的核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)、瓊脂糖和PCR 試劑。

1.3 擴(kuò)增碳青霉烯酶基因 依據(jù)文獻(xiàn)［5］依次擴(kuò)增碳青霉烯酶耐藥基因,生工(上海)生物工程有限公司完成引物合成和擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序。

1.4 質(zhì)粒接合、S1-PFGE 參照文獻(xiàn)［6］操作,電泳條件：轉(zhuǎn)換時(shí)間0.3～45.0 s,轉(zhuǎn)角120,場(chǎng)強(qiáng)6 V,電泳時(shí)間18 h。

1.5 質(zhì)粒的高通量測(cè)序 基于Illumina MiSeq 和MinION 平臺(tái)對(duì)接合子攜帶的質(zhì)粒測(cè)序,然后,利用ResFinder 等軟件分析質(zhì)粒。

2 結(jié)果

2.1 碳青霉烯酶基因、質(zhì)粒接合和藥敏結(jié)果 PCR 擴(kuò)增雷極普羅威登菌QD51 株的碳青霉烯酶基因,結(jié)果顯示該株NDN 基因陽(yáng)性,經(jīng)測(cè)序比對(duì)為NDM-1 型,但其他碳青霉烯酶耐藥基因未檢測(cè)到。雷極普羅威登菌QD51 株與受體菌大腸埃希菌J53AziR經(jīng)液相接合,獲得了接合子QD51C,經(jīng)擴(kuò)增和測(cè)序驗(yàn)證該接合子也攜帶NDM-1 基因,表明接合成功。供體菌雷極普羅威登菌QD51、接合子QD51C 和受體菌大腸埃希菌J53AziR的藥敏結(jié)果。見(jiàn)表1。

表1 雷極普羅威登菌QD51 株和接合子QD51C 及大腸埃希菌J53AziR 的藥敏

2.2 質(zhì)粒的S1-PFGE 和高通量測(cè)序結(jié)果 對(duì)雷極普羅威登菌QD51 株與接合子QD51C 的S1-PFGE 顯示,兩者都攜帶1 個(gè)質(zhì)粒,大小約138 kb,將該質(zhì)粒命名為pNDM-QD51,電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。利用高通量測(cè)序平臺(tái)獲得了質(zhì)粒pNDM-QD51 的全序列(GenBank:MH236906),然后經(jīng)軟件分析質(zhì)粒的生物信息,結(jié)果顯示：質(zhì)粒pNDM-QD51 全長(zhǎng)為134802 bp,屬于IncA/C 型,且含有blaNDM-1和blaCMY-6基因；該質(zhì)粒包含骨架區(qū)和附屬區(qū)；骨架區(qū)主要包括質(zhì)粒復(fù)制起始、穩(wěn)定性和接合轉(zhuǎn)移基因；附屬區(qū)又包含了ISEcp1-blaCMY-6unit 和MDR region of pNDM-QD51。

圖1 雷極普羅威登菌S1-PFGE 電泳圖

3 討論

近十幾年來(lái),由于不合理使用抗菌藥物,耐碳青霉烯類腸桿菌目細(xì)菌的分離率逐年增加。除了常見(jiàn)的肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌外,耐碳青霉烯類雷極普羅威登菌在國(guó)內(nèi)外也都有報(bào)道。這些菌對(duì)碳青霉烯類的耐藥機(jī)制主要與其產(chǎn)碳青霉烯酶有關(guān)［3］。

NDM-1 為2010 年發(fā)現(xiàn)的金屬酶,屬于B 類β-內(nèi)酰胺酶,由blaNDM-1基因編碼。除了氨曲南外,該酶對(duì)包括碳青霉烯類在內(nèi)的β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥［7］。已報(bào)道blaNDM-1基因常常分離自肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌和陰溝腸桿菌等。但是,NDM-1 雷極普羅威登斯菌屬的相關(guān)報(bào)道較少。本研究為中國(guó)兒童感染產(chǎn)NDM-1 的雷極普羅威登斯菌的報(bào)道。該雷極普羅威登菌QD51 株呈現(xiàn)對(duì)哌拉西林/他唑巴坦、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟、而他培南、亞胺培南、美羅培南、磷霉素素和環(huán)丙沙星不敏感或耐藥,而且通過(guò)接合試驗(yàn)傳遞給接合子。

研究發(fā)現(xiàn),blaNDM-1基因多數(shù)位于質(zhì)粒上,而攜帶該基因質(zhì)粒的的水平傳播是產(chǎn)NDM-1 細(xì)菌廣泛流行的主要原因。這些質(zhì)粒大小在50000～340000 bp 之間不等［8］,并通過(guò)接合轉(zhuǎn)移到其它菌株中,從而使其它菌株獲得抗性。另外,blaNDM-1基因多數(shù)位于廣宿主質(zhì)粒,如IncA/C 和IncL/M,但也可以在窄宿主質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn),即,表示在不同種屬之間可以快速傳播。本研究利用高通量測(cè)序獲得了雷極普羅威登菌QD51 株攜帶的質(zhì)粒pNDM-QD51 的全序列,其全長(zhǎng)為134802 bp,屬于IncA/C 型,且含有blaNDM-1和blaCMY-6基因。該質(zhì)粒骨架區(qū)主要包括質(zhì)粒復(fù)制起始、穩(wěn)定性和接合轉(zhuǎn)移基因,而附屬區(qū)包含了ISEcp1-blaCMY-6unit 和MDR region of pNDM-QD51 兩部分。這與Humberto 等［9］報(bào)道的普羅威登菌攜帶blaNDM-1基因質(zhì)粒為310,000 bp 不盡相同。另外,雷極普羅威登菌blaNDM-1基因也可位于染色體上,表明該基因既可以通過(guò)質(zhì)粒在同種或不同種細(xì)菌之間傳播,還可以整合到細(xì)菌染色體上進(jìn)行重組傳播［10］。

產(chǎn)NDM-1 細(xì)菌往往同時(shí)攜帶其它的耐藥基因,如分離株P(guān).stuartii PS1 同時(shí)攜帶TEM-1、OXA-1、CMY-6 和RmtC 基因［10］。在本研究中,雷極普羅威登菌QD51 株還攜帶blaCMY-6基因,表現(xiàn)對(duì)碳青霉烯類和頭孢菌素類耐藥。由于雷極普羅威登菌對(duì)替加環(huán)素和多粘菌素天然耐藥,患者又是兒童,這對(duì)臨床抗感染治療藥物是一個(gè)棘手的問(wèn)題。

綜上所述,本研究表明雷極普羅威登菌臨床株QD51 對(duì)碳青霉烯酶類耐藥與其blaNDM-1和blaCMY-6基因有關(guān),應(yīng)引起臨床重視,并加強(qiáng)醫(yī)院感染的的監(jiān)測(cè)和抗生素的合理應(yīng)用。