高海慧，王建東，高小斐，王培柱，吳學(xué)青，厲 龍，康曉冬

(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，寧夏銀川 750002；2.陜西省榆林市定邊縣樊學(xué)鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，陜西定邊 718699；3.寧夏吳忠市利通區(qū)扁擔(dān)溝鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作站，寧夏吳忠 751100；4.寧夏石嘴山市惠農(nóng)區(qū)動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，寧夏平羅 753200)

犢牛腹瀉是犢牛飼養(yǎng)中常見(jiàn)的、危害性較大的一種傳染性疾病,由致病性大腸埃希氏菌引起的占90%[1]，尤其使得7日齡以內(nèi)犢牛出現(xiàn)腹瀉，其發(fā)病率較高[1]、病死率很高[2]。 臨床上主要表現(xiàn)為動(dòng)物消化機(jī)能損傷,出現(xiàn)腹瀉、發(fā)熱、脫水、消瘦，急性病例可突然死亡。在大群飼養(yǎng)環(huán)境中,犢牛腹瀉發(fā)病可達(dá)90%～100%，病死率高達(dá)30%以上[1]。大腸埃希氏菌是獸醫(yī)臨床上最常見(jiàn)的病原之一[3]，也是人和動(dòng)物的腸道組織中探索較為清楚的細(xì)菌之一[4]。大腸埃希氏菌是一種條件性致病菌，受到環(huán)境、應(yīng)激、自身免疫力等影響會(huì)引起發(fā)病，患病機(jī)體還可能繼發(fā)感染其他病原，呈地域性流行。大腸埃希氏菌的血清型眾多，給大腸埃希氏菌病的預(yù)防帶來(lái)困難，目前仍沒(méi)有有效的疫苗可用于大腸埃希氏菌病的預(yù)防[5]，使用廣譜抗菌藥物為主要的治療手段，抗菌藥物在各個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的普遍和大量使用使得大腸埃希氏菌耐藥性問(wèn)題越發(fā)嚴(yán)重，包括禽、豬、牛、羊等源性菌[6-9]。大腸埃希氏菌的致病性越來(lái)越強(qiáng)，耐藥性和多重耐藥性也就越來(lái)越強(qiáng)，二者之間存在密切的聯(lián)系[10-11]，同時(shí)，細(xì)菌的毒力與其毒力島有著密切聯(lián)系。腸細(xì)胞脫落位點(diǎn) (locus of enterocyte effacement, LEE) 毒力島。主要對(duì)動(dòng)物的腸黏膜細(xì)胞產(chǎn)生黏附-抹去損傷，ler基因?yàn)長(zhǎng)EE毒力島中心調(diào)節(jié)基因，eaeA基因編碼外膜蛋白緊密素[6]。因此，本試驗(yàn)采集寧夏地區(qū)奶牛場(chǎng)1～2月齡腹瀉犢牛肛門(mén)拭子，開(kāi)展腹瀉源性大腸埃希氏菌的耐藥性及LEE毒力島攜帶檢測(cè)，以期為預(yù)防及治療犢牛腹瀉提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 于2018年1月至2019年9月采集寧夏地區(qū)5市16個(gè)規(guī)模化奶牛場(chǎng)腹瀉犢牛(1～2月齡)肛門(mén)拭子157份，裝于滅菌離心管收集，標(biāo)記時(shí)間，年齡，場(chǎng)別，4 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室增菌培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB)(20170704)，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基(EMB)(20170704)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(MAC)(20170831)，青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；16S rRNA、eaeA、ler基因擴(kuò)增引物，上海生物工程技術(shù)有限公司合成；藥敏試紙片，杭州天和微生物試劑有限公司；革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定卡、VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)，法國(guó)梅里埃公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL600、2×TaqPCR MasterMix，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 潔凈工作臺(tái)(SW-CJ-1FD),蘇凈集團(tuán)安泰公司產(chǎn)品；全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)(VITEK 2 Compact)，法國(guó)生物梅里埃股份有限公司產(chǎn)品； PCR儀(T-100)、電泳槽(Sub-Cell?GT Cell)、凝膠成像儀(Gel DocTMXR+)，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 大腸埃希氏菌的分離 無(wú)菌采集的肛門(mén)拭子放入營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)管，37℃培養(yǎng)16 h～24 h，增菌培養(yǎng)物接種于EMB、MAC，37℃培養(yǎng)16 h～24 h，疑似菌鏡檢純化。

1.2.2 大腸埃希氏菌菌種鑒定 鏡檢為桿菌，純化培養(yǎng)物用電子比濁儀測(cè)定菌液濃度并調(diào)整為0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝?，全自?dòng)微生物鑒定系統(tǒng)(VITEK 2 Compact)進(jìn)行菌種鑒定。

1.2.3 細(xì)菌16S rRNA鑒定 參考16S rRNA通用引物序列[12]，引物序列見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL，上游、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，2×TaqPCR Master Mix 25.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O補(bǔ)足。擴(kuò)增條件為：95℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 10 min，29個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序，測(cè)得序列進(jìn)行Blast比對(duì)。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 選擇19種藥敏紙片，采用K-B法,根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì) (CLSI) 標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

1.2.5 LEE相關(guān)基因PCR檢測(cè) 參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)ler[13]、eaeA[14]的特異性引物，具體見(jiàn)表1。eaeA、ler基因的PCR條件為：50 μL體系：2×TaqPCR MasterMix 25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板4 μL，ddH2O補(bǔ)全。eaeA基因的PCR條件為：94℃ 3 min；94℃ 30 s，66.1℃ 30 s，72℃ 1 min，29個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min；ler基因的PCR條件為94℃ 10 min；94℃ 40 s，57℃ 30 s，72℃ 30s，29個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min。

表1 16S rRNA和LEE基因檢測(cè)引物序列及大小

2 結(jié)果

2.1 疑似菌的分離鑒定

共采集157份奶牛犢牛腹瀉樣本，分離得到62株疑似大腸埃希氏菌，革蘭氏染色可見(jiàn)紅色、兩端鈍圓的短桿菌。純化培養(yǎng)后，VITEK 2 Compact進(jìn)行生化鑒定，根據(jù)生化反應(yīng)結(jié)果，初步確定均為大腸埃希氏菌。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 600; 1.陰性對(duì)照; 2～9.部分分離株16S rRNA PCR產(chǎn)物

2.2 大腸埃希氏菌的16S rRNA擴(kuò)增

提取2.1鑒定為E.coli的基因組DNA，擴(kuò)增16S rRNA基因，目的條帶為370 bp(圖2)，部分陽(yáng)性產(chǎn)物送測(cè)序，Blast比對(duì)確定為大腸埃希氏菌。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 600;1.陰性對(duì)照;2～13.部分分離株eaeA基因PCR產(chǎn)物

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

62株分離株對(duì)阿米卡星較為敏感，耐藥率為11.29%，對(duì)四環(huán)素耐藥率為100%耐藥，對(duì)阿莫西林、氟苯尼考、哌拉西林、氨芐西林、頭孢唑啉、復(fù)方新諾明、恩諾沙星、頭孢拉定、頭孢氨芐的耐藥率均大于90.00%，對(duì)頭孢曲松的耐藥率為87.10%，對(duì)鏈霉素、卡那霉素、諾氟沙星、慶大霉素、環(huán)丙沙星的耐藥率大于70%，對(duì)紅霉素、氧氟沙星的耐藥率分別為69.35%和58.06% 。具體見(jiàn)表1，按照藥物敏感程度依次排列。

表2 62株分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.4 LEE相關(guān)基因擴(kuò)增結(jié)果

LEE毒力島基因ler和eaeAPCR產(chǎn)物大小與預(yù)期相符，攜帶eaeA基因的檢出率為11.29%(7/62)，攜帶ler基因檢出率為79.03%(49/62)，共檢出攜帶ler和eaeA兩種基因大腸埃希氏菌2株，檢出率為3.23%(2/62)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 600;1～10.部分分離株ler基因PCR產(chǎn)物

3 討論

大腸埃希氏菌病是由致病性大腸埃希氏菌引起的以新生和幼齡動(dòng)物為主要感染者的腸道疾病，由某些血清型大腸埃希氏菌引起[15]，在嚴(yán)重情況下可導(dǎo)致死亡[16]。臨床上常見(jiàn)的動(dòng)物性細(xì)菌疾病的病原菌多為大腸埃希氏菌，產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌、腸致病性大腸埃希氏菌(EPEC)、腸出血性大腸埃希氏菌(ETEC)都是人獸共患的病原，牛是該病原的儲(chǔ)存庫(kù)[17]，細(xì)菌毒力影響動(dòng)物感染的嚴(yán)重程度和范圍[18]。牛源大腸埃希氏菌及菌株耐藥性可以通過(guò)食物鏈、接觸傳播等途徑傳染傳遞給人類，造成身體損害。毒力島是成簇排列的毒力相關(guān)基因，是為20 kb～100 kb大小的染色體DNA片段，致病性大腸埃希氏菌中都存在毒力島，可能是一個(gè)或多個(gè)。LEE可以在其編碼的蛋白質(zhì)的分泌作用下發(fā)生種與種之間的變異[19]。

3.1 大腸埃希氏菌耐藥嚴(yán)重

寧夏地區(qū)牛源大腸埃希氏菌的耐藥情況越來(lái)越嚴(yán)重，這與飼養(yǎng)管理、獸醫(yī)治療手段等密切相關(guān)。王理想等研究發(fā)現(xiàn)犢牛腹瀉大腸埃希氏菌對(duì)對(duì)恩諾沙星、頭孢噻吩不敏感，對(duì)慶大霉素、左氧氟沙星、卡那霉素高度敏感[20]。李慧等研究發(fā)現(xiàn)，石河子某牛場(chǎng)29 株?duì)倥８篂a大腸埃希氏菌對(duì)阿奇霉素最敏感,對(duì)頭孢他啶、恩諾沙星、卡那霉素等的耐藥率均大于58.62%,而對(duì)青霉素、鏈霉素等表現(xiàn)出耐藥性[21]。韓和祥發(fā)現(xiàn)，肉牛場(chǎng)致?tīng)倥８篂a的50株致病性大腸埃希氏菌對(duì)多黏菌素、強(qiáng)力霉素、磺胺間甲氧嘧啶耐藥嚴(yán)重，對(duì)頭孢克肟、頭孢曲松、頭孢他啶耐藥率較低[22]。吳同壘等發(fā)現(xiàn)，秦皇島地區(qū)的12株?duì)倥８篂a大腸埃希氏菌，對(duì)林可霉素100%耐藥，對(duì)慶大霉素和阿米卡星的耐藥率均為83.3%;對(duì)氧氟沙星和諾氟沙星最敏感[23]。本研究顯示分離株對(duì)阿米卡星較為敏感，耐藥率為11.29%，對(duì)四環(huán)素耐藥率為100%耐藥，對(duì)其他藥物的耐藥率均大于58.00%，大多數(shù)處于90%以上。大腸埃希氏菌對(duì)抗菌藥物的耐藥機(jī)制十分復(fù)雜[24]，耐藥基因和整合子介導(dǎo)的機(jī)制是其中兩種[25]。耐藥的大腸埃希氏菌引起的疾病給牧場(chǎng)防治帶來(lái)壓力，除了濫用、無(wú)序地使用抗生素外，養(yǎng)殖生產(chǎn)中還把抗菌藥作為飼料添加劑來(lái)預(yù)防疾病,造成抗生素的殘留和大腸埃希氏菌耐藥性增強(qiáng)[26]。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶/頭孢菌素酶(ESBLs/Ampc )大腸埃希氏菌是動(dòng)物傳染病的潛在傳染源[27]，很多β-內(nèi)酰胺酶的編碼基因已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)[28]，不同地區(qū)抗生素耐藥性有一定差異。我區(qū)治療相關(guān)疾病，可以首選阿米卡星。

3.2 LEE相關(guān)基因的檢測(cè)

LEE引起的病變?yōu)轲じ胶兔撀?，編碼的主要基因有eaeA、ler、espAB和SepA-I，LEE是外源基因，是為了適應(yīng)環(huán)境進(jìn)化而來(lái)的，它借助于插入序列、整合酶、轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒復(fù)制起始區(qū)等可移動(dòng)性元件進(jìn)入菌體[13]，使菌體產(chǎn)生毒力。大腸埃希氏菌通過(guò)細(xì)菌外膜蛋白緊密黏附素等局灶性黏附于小腸上皮細(xì)胞表面，引起病變。在腸桿菌科細(xì)菌中，LEE毒力島與致病性密切相關(guān)，常見(jiàn)于腸出血性大腸埃希氏菌和腸致病性大腸埃希氏菌[13,19]。本研究中的62株分離菌，eaeA基因的檢出率為11.29%(7/62)，ler基因檢出率為79.03%(49/62)，ler和eaeA兩種基因共同檢出率為3.23%(2/62)，可能所檢測(cè)的大腸埃希氏菌中一部分為非致病性大腸埃希氏菌，也可能攜帶其他毒力島的相關(guān)基因，還需要進(jìn)一步探索。LEE相關(guān)基因廣泛存在于各市區(qū)各奶牛場(chǎng)，可能是某些奶牛場(chǎng)犢牛腹瀉大腸埃希氏菌病的原因之一。寧夏地區(qū)人源LEE相關(guān)ler、eaeA基因的檢出率均為1.80% (3/167) ，低于研究中的檢出率，說(shuō)明寧夏地區(qū)1～2月齡犢牛是LEE大腸埃希氏菌的潛在宿主。