秦紅艷，范書田，楊義明，王衍莉，李嘉琪，張方舟，路文鵬，李昌禹

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112；2.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林 吉林 132109）

組培工廠化生產(chǎn)是現(xiàn)代化種業(yè)的一部分，是優(yōu)質(zhì)品種商品化的必然，旨在為生產(chǎn)提供大量優(yōu)質(zhì)的苗木，滿足生產(chǎn)需求。當(dāng)前，在蝴蝶蘭[1]、白芨[2]、草莓[3,4]、廣藿香[5]、蘋果[6]以及櫻桃[7]等無毒苗木已實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)，所培育的苗木抗性強(qiáng)，并大幅度提高了產(chǎn)品的品質(zhì)，減少了農(nóng)藥的施用，增強(qiáng)了果品的安全性。作為新興水果，軟棗獼猴桃的組培文獻(xiàn)資料比較少，涉及規(guī)?；墓S化生產(chǎn)的文獻(xiàn)更為鮮見，因此，進(jìn)行規(guī)模化的工廠化生產(chǎn)研究具有重要意義：一可了解規(guī)?；a(chǎn)上易出現(xiàn)的問題及其解決方案；二可為軟棗獼猴桃生產(chǎn)提供借鑒。作者為從業(yè)多年的科研人員，培育出‘佳綠’等多個性狀優(yōu)良的軟棗獼猴桃品種，為了促進(jìn)良種良法在生產(chǎn)上發(fā)揮應(yīng)有的作用，為企業(yè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者提供優(yōu)質(zhì)苗木，助力“三農(nóng)”建設(shè)，本團(tuán)隊進(jìn)行了軟棗獼猴桃‘佳綠’的組培工廠化快繁研究，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

于2019年1月下旬，從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所軟棗獼猴桃資源圃剪取無病蟲害的‘佳綠’越冬枝條，修剪長度30 cm以上，室溫自來水水插20～30 d，期間每隔2～3 d換水1次，待萌芽枝條長至15 cm以上時剪下，以備無菌接種。培養(yǎng)基為MS，附加NAA與BA等植物激素調(diào)節(jié)外植體的生長發(fā)育。

1.2 方法

1.2.1 外植體接種與增殖 將1.1中的水插萌芽枝條剪取成1芽1段，按照李昌禹等[8]的方法進(jìn)行無菌消毒與培養(yǎng)，將單芽莖段接種到已滅菌的MS繼代培養(yǎng)基上，置于光照條件下進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，光照10 h/d，溫度24±2℃。

1.2.2 生根及煉苗 連續(xù)繼代培養(yǎng)，每代培養(yǎng)周期為45 d左右，于2020年5月份完成增殖培養(yǎng)，之后采用穴盤基質(zhì)塊瓶外生根，即將成叢植株從組培瓶內(nèi)取出后，切下愈傷組織，將其分為單株無根植株，將其插入已完全浸泡透的基質(zhì)塊中?；|(zhì)塊需提前12 h浸泡，加入0.2%的多菌靈和0.02 mg/L IBA。

1.2.3 調(diào)查項(xiàng)目與計算方法 月增殖系數(shù)=小植株總數(shù)/瓶 接種小植株數(shù)/瓶，每處理調(diào)查50瓶，重復(fù)3次；瓶外生根率（%）=生根小植株數(shù)量 小植株總數(shù)100%，每處理調(diào)查5盤，重復(fù)3次；移栽成活率（%）=成活小植株數(shù)量 小植株總數(shù)100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種與繼代培養(yǎng)調(diào)查結(jié)果

經(jīng)過30 d以上的培養(yǎng)，接種枝段的芽萌發(fā)生長成小植株（圖1 a），待植株長出3～5片小葉時，將植株小心切下，略帶一些莖段，進(jìn)行第1次轉(zhuǎn)繼代培養(yǎng)（圖1 b），然后再經(jīng)過1次的轉(zhuǎn)繼代培養(yǎng)（圖1 c），小植株才能正常生長發(fā)育并形成健壯有增殖能力的外植體培養(yǎng)材料，材料進(jìn)入旺盛的增殖生長階段（圖1 d），再正常繼續(xù)培養(yǎng)4～5次后，就可進(jìn)入生根培養(yǎng)階段。接種期主要是嚴(yán)格規(guī)范無菌操作，以防材料污染造成生產(chǎn)失敗。表1所示小植株成活情況，可以看出初次接種及前2次的繼代接種繁殖系數(shù)較低，直到第3次繼代后，植株才進(jìn)入快速繁殖階段，繁殖系數(shù)達(dá)到3.2。

圖1 軟棗獼猴桃組培苗接種與繼代培養(yǎng)Fig.1 The tissue culture seedling inoculation and subculture of

表1 接種與繼代植株成活及繁殖情況Table 1 Survival and reproduction of plants in inoculation and subgeneration

2.2 生根調(diào)查結(jié)果

在組培苗達(dá)到目標(biāo)數(shù)量后，就需要進(jìn)行生根培養(yǎng)，以往都是進(jìn)行瓶內(nèi)生根，然后將生根的組培苗再煉苗2～3 d后移栽至土缽內(nèi)，待小植株經(jīng)過緩苗后，生長30～40 d，幼根已完全生長進(jìn)入土壤后，再帶土坨定植到大田進(jìn)行管理。而本次采用的是穴盤基質(zhì)瓶外生根，即將叢生組培苗（圖2 a）由瓶內(nèi)取出后，切下愈傷組織，將其分為單株無根植株（圖2 b），插入提前浸泡透的基質(zhì)塊中（圖2 c），經(jīng)過20～30 d的培養(yǎng)，即可完成生根（圖2 d），在基質(zhì)內(nèi)生根后的組培苗直接移栽定植到大田進(jìn)行育苗管理。

圖2 軟棗獼猴桃組培苗生根過程Fig.2 The rooting process of tissue culture seedling of

表2為瓶外生根率與瓶內(nèi)生根率對比。從表2可以看出，二者在生根率上無差異，但是瓶外生根是基質(zhì)生根，生根數(shù)量略高于瓶內(nèi)生根苗，而生根質(zhì)量方面兩種方式基本沒有差異，根系白凈，生長正常，粗細(xì)均勻。而相對于瓶內(nèi)生根，瓶外生根方式須根系較長。

表2 植株生根情況調(diào)查Table 2 The rooting investigation of plants

2.3 移栽調(diào)查結(jié)果

瓶內(nèi)生根與瓶外生根的苗，定植到大田的成活率有明顯的差異，造成這種差異的原因是瓶內(nèi)生根苗需要進(jìn)行兩次移栽，第1次是從培養(yǎng)瓶取出入土缽，此時由于幼苗根系稚嫩，植株易感染立枯病，造成一定的死亡率，成活率為95%，而移栽到大田時還有一部分苗木死亡，成活率為83%，因此總成活率為78.8%。而瓶外基質(zhì)塊生根，移栽成活率可達(dá)95%，見表3。從成本來看，瓶外生根簡化了操作流程，相對于瓶內(nèi)生根，可節(jié)約成本50%。

表3 植株移栽調(diào)查結(jié)果Table 3 Results of plant transplanting investigation

3 結(jié)果與討論

3.1 接種與繼代培養(yǎng)關(guān)鍵技術(shù)分析

材料的接種與繼代是組培成功最關(guān)鍵的一步，尤其是進(jìn)行工廠化生產(chǎn)，必須嚴(yán)格控制污染的數(shù)量，提高接種成活率，提高繼代增殖系數(shù)，這些技術(shù)是工廠化生產(chǎn)增量降本的關(guān)鍵技術(shù)，這些關(guān)鍵技術(shù)涉及到培養(yǎng)基的精確配制，如各種元素的分散與溶解以利于小植株的正常生長發(fā)育，適宜的激素濃度有利于前期獲得較高的增殖系數(shù)來迅速擴(kuò)大群體[9]，嚴(yán)格控制培養(yǎng)基的滅菌時間，以防有機(jī)物與糖類分解降低增殖系數(shù)，還要注意操作人員在接種繼代操作時的無菌流程規(guī)范化等各個生產(chǎn)環(huán)節(jié)。

在本生產(chǎn)過程中，可以看出組培苗繼代培養(yǎng)前2代的繁殖系數(shù)均較低，直到第3代繁殖系數(shù)可達(dá)3.2，因此，為了獲得較高數(shù)量的苗木，至少要繼代4次以上。而很多研究表明，組培過程中，隨著繼代次數(shù)的增加，植株變異幾率不斷增加，如香蕉[10]和番木瓜[11]組培苗隨著繼代次數(shù)的增加，變異率大大增加，香蕉和番木瓜的培養(yǎng)代數(shù)控制在10代和32代內(nèi)。而很多研究也表明器官型繁殖方法，即通過刺激腋芽萌發(fā)或誘導(dǎo)容易產(chǎn)生不定芽的根莖產(chǎn)生不定芽的繁殖方法，其遺傳穩(wěn)定性較好。因此，為了獲得較多數(shù)量的苗木，可以適當(dāng)增加繼代次數(shù)，但也要控制繼代次數(shù)，建議繼代10次較好。

3.2 生根與移栽關(guān)鍵技術(shù)分析

本團(tuán)隊以往都是進(jìn)行瓶內(nèi)生根，生產(chǎn)成本占總成本的50%左右，因?yàn)?0萬株組培苗的生產(chǎn)培養(yǎng)瓶的基數(shù)近2萬瓶（6～7株/瓶，才能保證后續(xù)成活10萬株苗木）。而本次采用的是穴盤基質(zhì)塊瓶外生根，在穴盤基質(zhì)內(nèi)生根后的組培苗可直接移栽至大田進(jìn)行育苗管理，節(jié)省了人力物力和資金（瓶內(nèi)生根與帶土坨移栽）；與瓶內(nèi)生根相比，瓶外生根操作簡單，且生根效果基本沒有差異，移栽成活率高，能大幅度提高效率和降低成本。采用瓶外基質(zhì)生根后直接移至大田，減少了瓶內(nèi)生根苗移入土缽的步驟，是提高苗木成活苗率的關(guān)鍵。