馮鐸， 徐菲， 劉堯， 鄒天輝， 王寰昱， 鄒家威

甲狀腺癌是臨床常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，具有生長緩慢及惡性程度低等特征，早期無明顯癥狀；中晚期可表現(xiàn)為腫塊質(zhì)硬、吞咽困難、聲帶壓迫及頸交感神經(jīng)結(jié)節(jié)受壓等癥狀，影響患者的生活質(zhì)量[1-2]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，約90%的甲狀腺癌為分化型甲狀腺癌(differentiated thyroid carcinoma, DTC)，其病因較為復(fù)雜，與癌細(xì)胞生長因子、電離輻射、家族遺傳史及雌激素過量分泌等有關(guān)[3-4]。臨床治療DTC以手術(shù)切除為主，但仍有部分患者出現(xiàn)預(yù)后不良[5]。研究發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是DTC預(yù)后不良的獨立影響因素[6]。通過超聲檢查、甲狀腺球蛋白檢測可判定DTC的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移情況，但甲狀腺球蛋白水平易受到甲狀腺球蛋白抗體及促甲狀腺激素等因素的干擾，準(zhǔn)確度受限；超聲檢查因圖像清晰度及腫瘤邊界模糊等原因也易造成誤診、漏診[7-8]。因此尋找有效的指標(biāo)評估DTC轉(zhuǎn)移情況、制定治療方案及改善生活質(zhì)量具有重要意義。β-連環(huán)素蛋白為細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白，其在介導(dǎo)細(xì)胞黏附、參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控組織形態(tài)等方面具有重要的生理功能，在胃癌、前列腺癌及乳腺癌等疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起重要作用[9-10]，但關(guān)于DTC細(xì)胞轉(zhuǎn)移的研究相對較少。本研究通過檢測DTC組織中β-連環(huán)素蛋白的表達情況，探討β-連環(huán)素蛋白預(yù)測DTC轉(zhuǎn)移的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年2月至2019年10月華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院收治的423例DTC患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)影像學(xué)、術(shù)后病理學(xué)檢查等手段確診為DTC；②首次診斷為DTC，且未經(jīng)手術(shù)、化療等系統(tǒng)治療；③年齡18～75歲；④臨床資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有自身免疫系統(tǒng)疾病及凝血功能障礙者；②合并有其他器官惡性腫瘤者；③合并心臟、肝及腎等器官衰竭者；④合并甲狀腺囊腫、甲狀腺炎等甲狀腺疾?。虎莶慌浜喜±斫M織采集或已放棄治療者。本組患者中男123例，女300例；組織學(xué)類型：乳頭狀癌297例，濾泡癌126例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期232例，Ⅲ～Ⅳ期191例。根據(jù)術(shù)后病理結(jié)果，將患者分為轉(zhuǎn)移組(73例)和未轉(zhuǎn)移組(350例)，轉(zhuǎn)移組患者中有37例頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，19例縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，10例肺轉(zhuǎn)移，6例骨轉(zhuǎn)移，1例腦轉(zhuǎn)移。本研究方案經(jīng)我院倫理委員會審核批準(zhǔn)，患者及其家屬同意并簽署知情同意書。

1.2 基線資料收集 研究人員自行設(shè)計調(diào)查問卷，從電子病例系統(tǒng)中收集患者性別、年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)類型、TNM分期、腺外侵犯及病灶位置等臨床病理資料，雙人復(fù)核，確保采集數(shù)據(jù)的可靠性和準(zhǔn)確性。

1.3 免疫組化法檢測β-連環(huán)素蛋白表達 于術(shù)前用穿刺法采集DTC組織樣本，樣本不得出現(xiàn)滲血或缺血壞死等情況，用4%甲醛溶液固定，包埋DTC組織，制成厚4 μm的切片；用不同濃度乙醇水溶液脫蠟水化，3%過氧化氫水溶液封閉內(nèi)源性過氧化氫酶，微波中、高、低火修復(fù)抗原；加入鼠抗人β-連環(huán)素蛋白單克隆一抗(上海晅科生物科技有限公司)，37 ℃孵育2 h，棄去一抗后滴加二抗，37 ℃孵育40 min，棄去PBS緩沖液(北京百奧萊博科技有限公司)。在備用樣品中加入DAB顯色劑(北京百奧萊博科技有限公司)避光顯色3～5 min，蘇木精染色5 min，脫水至透明色后采用中性樹膠封片，由高年資經(jīng)驗豐富的醫(yī)護人員雙盲法判斷：在400倍顯微鏡(廣州市巨璟儀器有限公司)下任意選擇切片的10個視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞，染色程度判定標(biāo)準(zhǔn)：0分，幾乎無著色；1分，淺黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。陽性細(xì)胞率判定標(biāo)準(zhǔn)：0分，陽性細(xì)胞率<10%；1分，陽性細(xì)胞率10%～25%；2分，陽性細(xì)胞率26%～50%；3分，陽性細(xì)胞率>50%。根據(jù)染色程度和陽性細(xì)胞率的評分乘積判定β-連環(huán)素蛋白表達情況：≤2分為陰性表達，>2分為陽性表達[11]。

2 結(jié)果

2.1 β-連環(huán)素蛋白表達情況 免疫組化結(jié)果顯示，β-連環(huán)素蛋白在DTC組織中主要表達于細(xì)胞膜上，呈棕黃色，見圖1。

圖1 β-連環(huán)素蛋白在分化型甲狀腺癌組織中的陽性(1A)及陰性(1B)表達圖(免疫組化 ×200)

2.2 β-連環(huán)素蛋白表達與患者臨床病理特征的關(guān)系 β-連環(huán)素蛋白表達與腫瘤直徑、TNM分期及腺外侵犯相關(guān)(P<0.05)，與性別、年齡、組織學(xué)類型及病灶位置無關(guān)(P>0.05)，見表1。

表1 β-連環(huán)素蛋白表達與分化型甲狀腺癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 轉(zhuǎn)移組與未轉(zhuǎn)移組的臨床病理參數(shù)及β-連環(huán)素蛋白表達水平比較 兩組患者的性別、組織學(xué)類型、腺外侵犯差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。兩組患者年齡、腫瘤直徑、TNM分期及病灶位置差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，轉(zhuǎn)移組的β-連環(huán)素蛋白表達水平明顯高于未轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見表2。

表2 轉(zhuǎn)移組與未轉(zhuǎn)移組患者的臨床病理參數(shù)及β-連環(huán)素蛋白表達水平比較

2.4 β-連環(huán)素蛋白對DTC轉(zhuǎn)移的診斷效能 以病理組織學(xué)診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，β-連環(huán)素蛋白評分為檢驗變量，DTC有無轉(zhuǎn)移為狀態(tài)變量，以“敏感度”為Y軸，“1-特異度”為X軸繪制ROC曲線(圖2)。根據(jù)ROC曲線，β-連環(huán)素蛋白評分診斷DTC轉(zhuǎn)移的臨界值為4.08分，其對應(yīng)的敏感度為65.75%(48/73)，特異度為69.43%(243/350)，陽性預(yù)測值為30.97%(48/155)，陰性預(yù)測值為90.67%(243/268)，約登指數(shù)為0.352，ROC曲線下面積(AUC)為0.708(95%CI：0.645～0.772)，具有一定的預(yù)測價值。

圖2 β-連環(huán)素蛋白評分診斷分化型甲狀腺癌轉(zhuǎn)移的ROC曲線

2.5 Logistic回歸分析DTC轉(zhuǎn)移的影響因素 以DTC是否發(fā)生轉(zhuǎn)移為因變量，以表2中的所有臨床病理參數(shù)指標(biāo)和β-連環(huán)素蛋白評分為自變量，行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，β-連環(huán)素蛋白評分>4.08分、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期及腫瘤直徑>1.0 cm是DTC轉(zhuǎn)移的獨立危險因素(P<0.05)，見表3。

表3 Logistic回歸分析DTC轉(zhuǎn)移的影響因素

3 討論

DTC以甲狀腺腫大或結(jié)節(jié)為初始癥狀，隨著癌癥的發(fā)生、發(fā)展，會出現(xiàn)聲帶嘶啞、吞咽困難及呼吸阻塞等癥狀[12]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，DTC具有發(fā)展緩慢、惡性程度低及病程長等特點，因此預(yù)后較好，患者10年生存率高達90%，但約有10%的DTC患者會發(fā)生肺、骨及腦轉(zhuǎn)移等。DTC骨轉(zhuǎn)移患者的10年生存率為15%左右，是目前DTC患者死亡的主要原因之一[13-14]，因此找尋能有效預(yù)測DTC轉(zhuǎn)移的指標(biāo)，對改善患者生存質(zhì)量，提高生存率具有重要意義。甲狀腺功能指標(biāo)在初篩甲狀腺功能及腫塊良惡性方面具有一定優(yōu)勢，但其干擾因素較多，易受甲狀腺炎等疾病的影響，且在預(yù)測甲狀腺癌轉(zhuǎn)移方面的能力有限[15]。β-連環(huán)素蛋白是一種多功能結(jié)構(gòu)蛋白，可通過細(xì)胞骨架、信號通路傳導(dǎo)等方式調(diào)控細(xì)胞生長、分化及增殖等，且其作為轉(zhuǎn)錄因子可在DNA合成中調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達[16]。Leung等[17]研究表明β-連環(huán)素蛋白在肝癌中高表達，其可促進肝癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及包膜形成。Shen等[18]研究發(fā)現(xiàn)β-連環(huán)素蛋白在甲狀腺癌組織中異常表達，參與癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。而趙文輝[19]研究證實β-連環(huán)素蛋白陽性表達患者的5年生存率為87.93%，低于陰性表達患者的91.38%，提示可將β-連環(huán)素蛋白應(yīng)用于甲狀腺癌預(yù)后的預(yù)測。

席雪華等[20]綜述20%～90%的患者會發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，約30%的DTC患者治療后會出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，均明顯高于本研究中的17.26%(73/423)的轉(zhuǎn)移率，可能與研究樣本的選擇有關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，β-連環(huán)素蛋白半定量評分>4.08分、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期及腫瘤直徑>1.0 cm是DTC轉(zhuǎn)移的獨立危險因素，其中TNM分期Ⅲ～Ⅳ期患者發(fā)生DTC轉(zhuǎn)移的概率是Ⅰ～Ⅱ期的1.735倍，TNM分期的評判標(biāo)準(zhǔn)是原發(fā)腫瘤位置、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的情況，分期越高，癌癥細(xì)胞惡性程度越嚴(yán)重，預(yù)后越差；腫瘤直徑與腫瘤大小及負(fù)荷緊密聯(lián)系，腫瘤體積越大，其越容易缺氧，對放、化療等手段產(chǎn)生天然排斥，降低對DTC的控制程度，易發(fā)生轉(zhuǎn)移。β-連環(huán)素蛋白作為多功能蛋白，在DTC等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，其可與細(xì)胞骨架協(xié)同作用，調(diào)控細(xì)胞的生長、分化及凋亡等過程，同時其可作為DNA翻譯過程中的轉(zhuǎn)錄因子，促進細(xì)胞分裂及增殖基因的表達。β-連環(huán)素蛋白作用于DTC轉(zhuǎn)移可能與以下兩方面有關(guān)：一方面，β-連環(huán)素蛋白可通過Wnt/β-連環(huán)素蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)甲狀腺上皮細(xì)胞間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化基因的表達，激活原癌基因，促進DTC的轉(zhuǎn)移、分化，影響預(yù)后；另一方面，細(xì)胞黏附因子能激活β-連環(huán)素蛋白信號通路，促進黑色素瘤的增殖、分化，促進DTC發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移及骨轉(zhuǎn)移等，嚴(yán)重威脅患者的生命安全[21-22]。王九龍等[23]研究62例DTC患者，表明β-連環(huán)素蛋白在癌組織中呈高表達狀態(tài)，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與本研究結(jié)果一致。本研究對象僅限于2013年2月至2019年10月期間我院收治的423例DTC患者，在醫(yī)護水平、治療方式、患者認(rèn)知程度等方面的差異可能使試驗結(jié)果出現(xiàn)偏差，仍需納入大量多中心樣本以驗證和補充研究結(jié)果。

綜上所述，β-連環(huán)素蛋白在DTC中異常表達，在預(yù)測甲狀腺癌轉(zhuǎn)移方面有一定的臨床價值，值得進一步研究并推廣應(yīng)用。