王翠艷，杜學(xué)孟，劉紅英，董曉云（通訊作者）

（濰坊醫(yī)學(xué)院 山東 濰坊 261053）

近年來研究表明，肥胖可影響精子的正常發(fā)育與成熟過程[1]，對精子質(zhì)量有著至關(guān)重要的影響[2]，但具體機(jī)制尚不明確。表觀遺傳改變在精子發(fā)育過程中的作用受到了越來越多的關(guān)注，如精子殘余組蛋白是否被正確修飾是精子正常發(fā)育和成熟的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究肥胖對雄性小鼠生殖系統(tǒng)的損傷及對殘余組蛋白H3乙?；揎椀挠绊?，以期從表觀遺傳學(xué)角度為男性不育的臨床治療提供新策略。

1.材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組建模

選取2019年10月—2020年6月健康SPF級(jí)C57BL/6雄鼠20只，周齡5周，初始體重19～20 g，隨機(jī)分為肥胖組和對照組。肥胖組選用高脂飼料配方喂養(yǎng)，對照組選用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，建模期間，兩組小鼠飲水光照等條件相同。

1.2 指標(biāo)檢測

1.2.1 標(biāo)本采集 定時(shí)監(jiān)測小鼠體重，建模成功后，稱量腹部脂肪，做血脂分析，取附睪做精子形態(tài)觀察，以及精子密度、活力參數(shù)、動(dòng)力參數(shù)檢測分析，并提取組織蛋白，做Western Blot免疫印跡實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 血脂檢測 用注射器抽取小鼠心臟血液約1 mL置于1.5 mL Ep管中，5 000 rpm，5 min離心取血清，使用全自動(dòng)生化分析儀做血清甘油三酯和總膽固醇檢測。

1.2.3 精子指標(biāo)分析 用偉力圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行精子形態(tài)、密度、活力、畸形率等參數(shù)的檢測。

1.2.4 組織蛋白提取及Western Blot免疫印跡 配制SDS-PAGE凝膠，加樣、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加一抗過夜，加二抗孵育2 h，ECL顯影檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1小鼠建模結(jié)果 肥胖組小鼠體重、腹部脂肪重量、血清甘油三酯、血清總膽固醇均高于對照組20%以上（圖1、圖2），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 兩組血清甘油三酯、血清總膽固醇對比

圖2 兩組小鼠體重、腹部脂肪對比

2.2 小鼠精子指標(biāo)分析結(jié)果

2.2.1 精子形態(tài)分析 與對照組相比，肥胖組小鼠精子正常精子形態(tài)率顯著降低，鏡下可見畸形精子，見表1、圖3。

表1 兩組小鼠精子形態(tài)率比較（±s）

表1 兩組小鼠精子形態(tài)率比較（±s）

分組 n 正常精子形態(tài)率/% P肥胖組 10 61.32±2.46 0.013對照組 10 83.37±2.87

圖3 精子形態(tài)分析

2.2.2 精子密度、活動(dòng)參數(shù)分析比較 肥胖組小鼠精子密度、精子活動(dòng)力均顯著低于對照組（P＜0.05），見表2、圖4。

表2 兩組小鼠精子密度、活動(dòng)參數(shù)分析比較（±s）

表2 兩組小鼠精子密度、活動(dòng)參數(shù)分析比較（±s）

分組 精子密度/（106·mL-1） 精子活動(dòng)率/% A級(jí)精子/%肥胖組 57.11±5.20 23.17±3.70 3.08±0.29對照組 100.30±15.01 45.67±5.49 8.37±1.06 P 0.027 0.023 0.016分組 B級(jí)精子/% C級(jí)精子/% D級(jí)精子/%肥胖組 6.51±1.58 10.49±2.27 76.82±3.70對照組 14.16±1.30 24.79±5.70 54.33±5.49 P 0.042 0.040 0.023

圖4 小鼠精子密度、活動(dòng)參數(shù)分析比較

2.2.3 精子動(dòng)力參數(shù)分析比較 對比兩組小鼠精子的動(dòng)力參數(shù)發(fā)現(xiàn)，除MAD、BCF、WOB（P＞0.05）之外，其余參數(shù)均有顯著差異（P＜0.05），見表3、圖5。

圖5 小鼠精子動(dòng)力參數(shù)分析比較

表3 兩組小鼠精子動(dòng)力參數(shù)分析比較（±s）

表3 兩組小鼠精子動(dòng)力參數(shù)分析比較（±s）

動(dòng)力參數(shù) 肥胖組 對照組 P曲線速度VCL/（um·s-1） 35.10±1.31 42.14±1.28 0.002直線速度VSL/（um·s-1） 15.40±0.94 20.28±1.60 0.045平均路徑速度VAP/（um·s-1） 19.97±1.07 25.16±1.27 0.033平均移動(dòng)角度MAD/° 76.68±0.51 72.65±5.38 0.460側(cè)擺幅度ALH/μm 2.10±0.09 3.27±0.36 0.025鞭打頻率BCF/Hz 7.86±0.41 6.99±0.61 0.317直線性LIN/% 39.68±0.86 49.46±3.98 0.048擺動(dòng)性WOB/% 53.78±1.67 59.39±3.97 0.190前向性STR/% 70.32±1.23 80.19±1.75 0.016

2.3小鼠精子組蛋白H3K56乙酰化水平檢測分析結(jié)果

肥胖組小鼠精子殘余組蛋白H3K56乙?；潭蕊@著低于對照組（P=0.0063＜0.01），見表4、圖6。

表4 兩組小鼠AcH3K56乙酰化蛋白免疫印跡灰度值對比分析

圖6 Graghpad軟件對免疫印跡條帶灰度分析

3.討論

最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，目前世界范圍內(nèi)約7%的男性受到不育的困擾[4]。其中，遺傳因素占10%～15%[5]。除遺傳因素外，環(huán)境因素對男性生殖健康的影響同樣至關(guān)重要，如內(nèi)分泌紊亂、肥胖、激素疾病、睪丸損傷、泌尿生殖系統(tǒng)感染等[6]。

早在2006年，研究者就已發(fā)現(xiàn)肥胖與男性不育呈負(fù)相關(guān)[7]。近年來，在臨床就診的男性不育癥患者中，肥胖患者呈持續(xù)增加趨勢[8]。關(guān)于肥胖對精子指標(biāo)的影響眾說紛紜，本次結(jié)果顯示，肥胖小鼠精子形態(tài)出現(xiàn)明顯異常，且精子密度、活動(dòng)參數(shù)均顯著低于對照組（P＜0.05），動(dòng)力參數(shù)結(jié)果不一致，其中精子曲線速度、直線速度、平均路徑速度、側(cè)擺幅度、直線性百分率、前向性百分率兩組比較均有顯著差異（P＜0.05），而精子平均移動(dòng)角度，鞭打頻率與擺動(dòng)性百分率兩組之間無顯著差異（P＞0.05）。

既往研究表明，肥胖可通過影響下丘腦垂體性腺軸直接影響男性生殖健康[9]，可以通過增高代謝率，增加活性氧形成，影響精子正常生理功能。除上述機(jī)制外，近年來發(fā)現(xiàn)肥胖可引起精子表觀遺傳修飾異常，進(jìn)而影響其正常功能。參與這一過程的遺傳機(jī)制主要包括DNA甲基化、殘余組蛋白修飾及精子小RNA變化等[10]。其中殘余組蛋白的不同表觀修飾方式對精子正常生長發(fā)育起著重要的調(diào)控作用，它們的相互協(xié)調(diào)可以保證精子表型的正常表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肥胖組小鼠精子殘余組蛋白AcH3K56乙酰化程度顯著低于對照組，差異顯著（P＜0.01）。

綜上所述，肥胖可以影響精子正常功能與形態(tài)，同時(shí)降低殘余組蛋白H3乙?；揎棾潭取＿@一發(fā)現(xiàn)將會(huì)為臨床男性不育癥患者的治療提供新的策略和方向。