張理火 何麗娟 劉璐

摘 要 目的：建立高效液相色譜法測(cè)定豬凝血酶中蔗糖含量，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。方法：根據(jù)分子排阻色譜法，以親水硅膠高效體積排阻色譜柱進(jìn)行分離，采用示差折光檢測(cè)器測(cè)定蔗糖含量。結(jié)果：該方法專屬性強(qiáng)，線性范圍為0.518～1.658 mg/ml；低、中、高3組濃度蔗糖的平均回收率分別為98.74%、99.35%、100.22%，總平均回收率為99.44%（n=9），相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.82%（n=9）；中間精密度RSD為1.65%（n=12）。結(jié)論：該方法專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度、精密度、耐用性良好，適用于豬凝血酶中蔗糖含量測(cè)定。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜法 豬凝血酶 蔗糖

中圖分類號(hào)：R973.1； O657.72 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2021）07-0072-04

Determination of sucrose content in porcine thrombin by HPLC

ZHANG Lihuo1，2*， HE Lijuan2， LIU Lu1，2**

（1. Shanghai Haohai Biotechnology Co.， Ltd.， Shanghai 201613， China； 2. Shanghai Li Kang Rui Biological Engineering Co.， Ltd.， Shanghai 201707， China）

ABSTRACT Objective： To establish a method for the determination of sucrose content in porcine thrombin by HPLC. Methods： Based on molecular exclusion chromatography and hydrophilic silica gel column with high efficiency volume exclusion chromatography， the content of sucrose in porcine thrombin was determined by refractive index detector （RID）. Results： The method had strong specificity and the linear range was 0.518-1.658 mg/ml. The average recoveries at low， medium and high concentrations of sucrose were 98.74%， 99.35% and 100.22%， respectively and the overall average recovery was 99.44% （n=9）， and the overall relative standard deviation （RSD） was 0.82% （n=9）. The RSD obtained from the intermediate precision was 1.65%（n=12）. Conclusion： This method with good specificity， accuracy， precision and durability is suitable for the determination of sucrose content in porcine thrombin.

KEy WORDS HPLC； porcine thrombin； sucrose

豬源纖維蛋白黏合劑由豬纖維蛋白原、豬凝血酶及相應(yīng)溶解液組成，是臨床常用的輔助止血藥[1]。豬凝血酶由健康豬混合血漿，經(jīng)分離、提純、病毒滅活（S/D滅活和干熱滅活）、凍干等制成，其中干熱病毒滅活和凍干過(guò)程易致使蛋白變性，需加入蛋白保護(hù)劑。目前國(guó)內(nèi)使用的保護(hù)劑包括單獨(dú)使用蔗糖、使用一種或多種氨基酸或者蔗糖和氨基酸聯(lián)合使用等[2]。蔗糖是生物制品中常用的保護(hù)劑，具有賦形和抗氧化的作用，其含量與制品的穩(wěn)定性息息相關(guān)[3-4]。2015年版《中國(guó)藥典》四部通則<3120>人血液制品中糖及糖醇含量測(cè)定方法采用離子色譜法[5]，但蔗糖在高溫干熱滅活過(guò)程中易發(fā)生碳化或水解，表現(xiàn)為非單一的色譜峰，且與制品中常用的抗凝劑-枸櫞酸離子峰存在干擾，導(dǎo)致無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)定[2]。另外，藥典方法中供試品溶液的處理過(guò)程需加入磺基水楊酸除蛋白，但蔗糖在此酸性條件下易緩慢水解成果糖和葡萄糖，致使主峰下降、定量不準(zhǔn)確[2]。因此，蔗糖含量的準(zhǔn)確測(cè)定對(duì)生物制品的質(zhì)量控制具有重要意義。本研究根據(jù)分子排阻色譜法，采用示差折光檢測(cè)器測(cè)定豬凝血酶中蔗糖含量，并對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

豬凝血酶（批號(hào)20191109、20191213、20200108）由本公司生產(chǎn)；蔗糖（HPLC級(jí)別，批號(hào)D1527058）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇（HPLC級(jí)，批號(hào)110268）購(gòu)自Hipure Chem公司；自制純化水。

1.2 主要儀器

1260高效液相色譜儀和示差折光檢測(cè)器購(gòu)自美國(guó)安捷倫科技公司；XSE電子分析天平、ME104電子天平購(gòu)自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；H1650臺(tái)式高速離心機(jī)（轉(zhuǎn)子型號(hào)：NO.3）購(gòu)自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 色譜條件

色譜柱：PL aquagel-OH 20色譜柱（7.5 mm ×30 cm，5 mm）+ 保護(hù)柱（7.5 mm×50 mm，5 mm）；柱溫35 ℃；流速0.7 ml/min；示差折光檢測(cè)器溫度35 ℃；進(jìn)樣量20 ml；流動(dòng)相：甲醇-水=46∶54（v/v）。

1.4 溶液配制

1）流動(dòng)相 量取460 ml甲醇和540 ml純水混合均勻。

2）對(duì)照品溶液 準(zhǔn)確稱取蔗糖對(duì)照品250 mg至50 ml容量瓶中，加水溶解，定容混勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液1 ml至5 ml容量瓶中，定容混勻，即得對(duì)照品溶液。

3）樣品溶液 取豬凝血酶1瓶，加2.5 ml熱水（75 ℃）溶解，放冷，8 000 r/min離心10 min收集上清液，即得樣品儲(chǔ)備液。精密量取樣品儲(chǔ)備液1 ml至5 ml容量瓶中，定容混勻，即得樣品溶液。

4）線性溶液 分別精密量取2.5、4、5、6、8 ml對(duì)照品儲(chǔ)備液至25 ml量瓶中，定容混勻，即得50%、80%、100%、120%和160%線性溶液。

5）準(zhǔn)確度溶液 精密量取對(duì)照儲(chǔ)備液0.8、1.0、1.2 ml和樣品儲(chǔ)備液0.8、1.0、1.2 ml至10 ml容量瓶中，定容混勻，每組平行配制3份，即得R80%-1～R80%-3、R100%-1～R100%-3和R120%-1～R120%-3準(zhǔn)確度溶液。

2 結(jié)果

2.1 專屬性

取空白溶液、對(duì)照品溶液和樣品溶液進(jìn)樣分析?？瞻兹芤簩?duì)對(duì)照品溶液和樣品溶液中蔗糖的保留時(shí)間（約14.2 min）沒(méi)有干擾（圖1），表明該方法專屬性良好。

2.2 線性

取50%、80%、100%、120%和160%的線性溶液進(jìn)樣分析，以蔗糖峰面積對(duì)蔗糖濃度作線性回歸，求得線性方程為y = 234 812.50x-24.61，線性范圍為0.518～1.658 mg/ml，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，符合接受標(biāo)準(zhǔn)（r≥0.990）。

2.3 準(zhǔn)確度

取R80%-1～R80%-3、R100%-1～R100%-3和R120%-1～R120%-3 3組準(zhǔn)確度溶液進(jìn)樣分析。3組平均回收率分別為98.74%、99.35%、100.22%，總平均回收率為99.44%，RSD為0.82%，滿足接受標(biāo)準(zhǔn)（RSD≤5.0%）（表1）。

2.4 精密度（重復(fù)性、中間精密度）

在不同日期，由兩位實(shí)驗(yàn)員平行配制6份樣品溶液進(jìn)樣分析。兩位實(shí)驗(yàn)員測(cè)得6份樣品的RSD分別為0.87%、0.73%，測(cè)得12份樣品的RSD為1.65%，均滿足接受標(biāo)準(zhǔn)（RSD≤5.0%）（表2）。

2.5 耐用性

在其他方法條件不變的前提下，調(diào)整流速至方法規(guī)定的±0.1 ml/min、流動(dòng)相比例至方法規(guī)定的±2%和檢測(cè)器溫度至方法規(guī)定的±2 ℃，取樣品溶液進(jìn)樣分析。各參數(shù)微調(diào)后測(cè)得含量與正常方法測(cè)得含量的比值符合接受標(biāo)準(zhǔn)（95.0%～105.0%）（表3），說(shuō)明該方法耐用性良好。

2.6 穩(wěn)定性

取室溫放置0、6、12、24、36、48 h的樣品溶液和對(duì)照溶液進(jìn)樣分析。對(duì)照溶液和樣品溶液在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)得含量與0時(shí)間點(diǎn)測(cè)得含量的比值均符合接受標(biāo)準(zhǔn)（95.0%～105.0%）（表4），表明對(duì)照溶液和樣品溶液穩(wěn)定性良好。

2.7 樣品檢測(cè)

取3批豬凝血酶，按1.4項(xiàng)制備樣品溶液和1.3項(xiàng)色譜條件分析，測(cè)得蔗糖含量分別為3.721、3.685、3.641 mg/ml。3批結(jié)果穩(wěn)定，說(shuō)明方法的適用性良好。

3 討論

本研究參照分子排阻色譜法[5]62-63和相關(guān)文獻(xiàn)[2-3， 6-7]，建立豬凝血酶中蔗糖含量的測(cè)定方法。本法樣品制備過(guò)程中，采用熱水溶解豬凝血酶，而由此高溫導(dǎo)致蛋白變性而析出的沉淀，采用離心去除，與文獻(xiàn)方法[2-3]和藥典方法[5]相比，無(wú)需加入磺基水楊酸蛋白沉淀劑，解決了蔗糖碳化或水解引起定量不準(zhǔn)確等問(wèn)題，從而提高了方法準(zhǔn)確性。豬凝血酶中加入的糖類保護(hù)劑不止一種，本法僅建立單一保護(hù)劑蔗糖含量的測(cè)定方法，后續(xù)將開(kāi)發(fā)一種能同時(shí)測(cè)定多種保護(hù)劑的測(cè)定方法。本研究方法易于操作，快速準(zhǔn)確，專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度、精密度、耐用性均良好，適用于豬凝血酶中蔗糖含量測(cè)定。

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