田偉 李葆林 張闖 甄亞欽 王鑫國 牛麗穎

摘要：為了提高薄荷配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，建立其多指標(biāo)定量評價(jià)體系，采用HPLC法同時(shí)測定薄荷配方顆粒中咖啡酸、橙皮苷、迷迭香酸、香葉木苷、香蜂草苷和蒙花苷6種成分的含量。采用Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，以甲醇（A）-乙腈（B）-5%冰乙酸（C）為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速為0.6 mL/min，柱溫為35 ℃，咖啡酸、迷迭香酸、蒙花苷的檢測波長為330 nm，橙皮苷、香蜂草苷的檢測波長為284 nm，香葉木苷的檢測波長為380 nm。結(jié)果表明，薄荷配方顆粒中6種待測成分的線性關(guān)系、分離度、重復(fù)性均符合要求，各成分的平均回收率分別為99.19%，98.06%，100.45%，98.90%，100.17%，99.78%。不同廠家的薄荷配方顆粒中6種化學(xué)成分的含量存在一定差異。建立的HPLC分析方法簡便、快速、準(zhǔn)確，可以為薄荷配方顆粒的質(zhì)量控制提供方法參考。

關(guān)鍵詞：中藥化學(xué);薄荷;配方顆粒;高效液相色譜法;含量測定

中圖分類號：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：ADOI： 10.7535/hbgykj.2021yx03004

Abstract：In order to improve the quality standard of Herba Menthae formula granules and establish a quantitative evaluation system of multiple indexes， the contents of caffeic acid， hesperidin， rosmarinic acid， diosmin， didymin and buddleoside in Herba Menthae formula granules were determined by using the method of HPLC. The analysis was carried out on Poroshell 120 EC-C18 column （4.6 mm×250 mm， 5 μm） by gradient elution with methanol （A）-acetonitrile （B）-5% acetic acid （C） as the mobile phase at the flow rate of 0.6 mL/min. The column temperature was set at 35 ℃. The detective wavelength were 330 nm for caffeic acid， rosmarinic acid and buddleoside， 284 nm for hesperidin and didymin， 380 nm for diosmin， respectively. The results show that the linear relationship， separation and repeatability of the six constituents in Herba Menthae formula granules all meet the requirements. The average recovery rates of the constituents are 99.19%， 98.06%， 100.45%， 98.90%， 100.17% and 99.78%， respectively. There are certain differences in the six chemical constituents in Herba Menthae formula granules from different manufacturers. The method of HPLC is simple， accurate and reproducible， which can provide a method reference for the quality control of Herba Menthae formula granules.

Keywords：chemistry of Chinese material medical; Herba Menthae; formula granules; HPLC; content determination

薄荷為唇形科植物薄荷Mentha haplocalyx Briq.的干燥地上部分，其性涼，味辛，歸肺、肝經(jīng)，具有疏散風(fēng)熱，清利頭目等功效[1]?，F(xiàn)代研究表明，薄荷所含化學(xué)成分復(fù)雜，主要有揮發(fā)油類、黃酮類、有機(jī)酸、氨基酸等化學(xué)成分[2]，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒和抗生育等多種藥理作用[3]。目前有關(guān)薄荷的研究主要集中于其揮發(fā)油部分，薄荷傳統(tǒng)用藥方式主要為水煎，因此揮發(fā)油并非其唯一藥效成分，但是關(guān)于薄荷非揮發(fā)性化學(xué)成分以及質(zhì)量控制的研究相對較少。徐晶晶等[4]建立了薄荷藥材特征圖譜，并釆用DPPH法、FRAP法分別測定其抗氧化活性，通過譜效關(guān)系研究表明薄荷中對抗氧化作用貢獻(xiàn)較大的化合物成分主要為黃酮類和酚酸類。薄荷黃酮類化合物目前主要分離出橙皮苷、蒙花苷、香葉木苷、香蜂草苷、香葉木素、蘆丁等，研究表明薄荷黃酮主要具有良好的抗炎、抗氧化、抗病毒等作用[5-6]。薄荷酚酸類化合物主要有迷迭香酸、咖啡酸、順式丹酚酸、紫草酸等，也是薄荷抗炎、抗菌、抗氧化活性的主要成分，與其臨床療效緊密聯(lián)系[7-8]。

配方顆粒是現(xiàn)代中藥飲片重要的發(fā)展形式，薄荷配方顆粒是以優(yōu)質(zhì)的薄荷飲片為原料，以水為溶媒經(jīng)現(xiàn)代工藝提取、濃縮、干燥、制粒而成的單味中藥顆粒劑，具有服用量小，攜帶保存方便，衛(wèi)生安全等優(yōu)點(diǎn)[9-12]。目前薄荷配方顆粒水溶性指標(biāo)成分為迷迭香酸，但是依靠單一成分定量的標(biāo)準(zhǔn)具有較強(qiáng)的局限性，因此需要建立薄荷配方顆粒中多指標(biāo)定量的評價(jià)體系。目前采用高效液相色譜法同時(shí)測定薄荷配方顆粒中非揮發(fā)性成分咖啡酸、橙皮苷、迷迭香酸、香葉木素、香蜂草苷和蒙花苷的含量未見文獻(xiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-DAD法同時(shí)測定薄荷配方顆粒中上述6種成分的含量，為薄荷配方顆粒質(zhì)量的有效控制提供方法參考和數(shù)據(jù)支撐。第3期田偉，等：HPLC法同時(shí)測定薄荷配方顆粒中6種成分的含量河北工業(yè)科技第38卷

1儀器與試劑

1.1儀器

LC-20A型高效液相色譜儀，日本島津公司提供;Poroshell 120 EC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），美國安捷倫公司提供;TB-215D電子天平（十萬分之一），BSA224S-CW電子天平（萬分之一），德國賽多利斯集團(tuán)提供;KQ-250型超聲波清洗器（功率250 W，頻率40 kHz），昆山超聲儀器有限公司提供。

1.2試劑

咖啡酸對照品（批號為110885-200102，純度為100.0%），橙皮苷對照品（批號為110721-201818，純度為96.2%），均購自中國食品藥品檢定研究院;迷迭香酸對照品（批號為111820-201404，純度為98.0%），蒙花苷（批號為111528-201509，純度為98.0%），均購自成都曼斯特生物技術(shù)有限公司;香葉木苷對照品（批號為PS020083，純度為98.0%），香蜂草苷對照品（批號為PS14081801，純度為98.0%），均購自成都普思生物科技股份有限公司;薄荷配方顆粒（編號為S1—S12）分別購自神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司、江陰天江藥業(yè)有限公司、華潤三九醫(yī)藥股份有限公司、四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司、廣東一方制藥有限公司、北京康仁堂藥業(yè)有限公司;乙腈、乙酸為色譜純，美國Fisher公司提供;水為超純水。

2實(shí)驗(yàn)方法

以薄荷配方顆粒為研究對象，參考文獻(xiàn)[11]—文獻(xiàn)[22]設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，完成方法學(xué)考察。

2.1對照品溶液的制備

精密稱取咖啡酸對照品、迷迭香酸對照品、香蜂草苷對照品適量分別置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得質(zhì)量濃度為0.384 8 mg/mL的咖啡酸儲備液、0.645 2 mg/mL的迷迭香酸儲備液、0.117 6 mg/mL的香蜂草苷儲備液;精密稱取橙皮苷對照品、香葉木苷對照品、蒙花苷對照品適量分別置于5 mL量瓶中，加二甲基亞砜溶解并稀釋至刻度，搖勻即得質(zhì)量濃度為2.472 0 mg/mL的橙皮苷儲備液、1.256 0 mg/mL的香葉木苷儲備液、2.900 0 mg/mL的蒙花苷儲備液;分別精密吸取各儲備液適量置于同一50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻即得每1 mL含咖啡酸7.70 μg、橙皮苷24.72 μg、迷迭香酸38.71 μg、香葉木苷12.56 μg、香蜂草苷7.06 μg、蒙花苷29.00 μg的混合對照品儲備液。

2.2供試品溶液的制備

取薄荷配方顆粒適量，研細(xì)，取約0.25 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)（下同）75%的甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，加75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3陰性對照溶液的制備

取糊精適量，按照2.2項(xiàng)中供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。

2.4色譜條件

色譜柱為Poroshell 120 EC-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;以甲醇（A）-乙腈（B）-5%冰乙酸（C）為流動(dòng)相，梯度洗脫程序見表1;咖啡酸、迷迭香酸、蒙花苷的檢測波長為330 nm，橙皮苷、香蜂草苷的檢測波長為284 nm，香葉木苷的檢測波長為380 nm;流速為0.6 mL/min;柱溫為35 ℃。

2.5方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性試驗(yàn)

精密吸取陰性對照溶液、混合對照品溶液和供試品溶液各10 μL，按2.4項(xiàng)中色譜條件（檢測波長為284 nm）測定，結(jié)果表明在該色譜條件下，輔料對樣品測定無干擾。結(jié)果見圖1。

2.5.2線性關(guān)系考察

精密量取2.1項(xiàng)中混合對照品溶液0.5，1，2，4，6 mL，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到系列濃度的6 種成分混合對照品溶液。分別精密吸取上述溶液及儲備液10 μL，按 2.4項(xiàng)中色譜條件（檢測波長為284 nm）測定，記錄峰面積。以峰面積為因變量、濃度為自變量進(jìn)行線性回歸分析，各組分在其相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表 2。

2.5.3精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算咖啡酸、橙皮苷、迷迭香酸、香葉木苷、香蜂草苷和蒙花苷的峰面積RSD分別為0.40%，0.32%，0.26%，0.26%，0.44%，0.27%，表明儀器精密度良好。

2.5.4穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別于0，2，6，12，20，30 h進(jìn)樣10 μL，按2.4項(xiàng)中色譜條件測定，計(jì)算咖啡酸、橙皮苷、迷迭香酸、香葉木苷、香蜂草苷和蒙花苷的峰面積RSD分別為0.16%，1.29%，0.81%，0.20%，1.19%，1.28%（n=6）。結(jié)果表明，供試品溶液在30 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批薄荷配方顆粒樣品（S9），分別取低（0.125 g）、中（0.25 g）、高（0.375 g）3個(gè)樣品量，每個(gè)樣品量3份，按供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，按2.4項(xiàng)中色譜條件測定，計(jì)算得到樣品中咖啡酸、橙皮苷、迷迭香酸、香葉木苷、香蜂草苷和蒙花苷的平均含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）分別為0.38，1.30，1.79，0.58，0.22，1.14 mg/g，RSD分別為0.77%，1.05%，1.21%，2.37%，2.14%，2.53%（n=6）。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.6加樣回收率試驗(yàn)

取同一批已知含量的薄荷配方顆粒（S9）9份，按每3份為一組，每組精密加入對照品咖啡酸、橙皮苷、迷迭香酸、香葉木苷、香蜂草苷和蒙花苷的量相當(dāng)于薄荷配方顆粒中各對照品含量的50%，100%，150%，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按2.4項(xiàng)中色譜條件測定，分別計(jì)算咖啡酸、橙皮苷、迷迭香酸、香葉木苷、香蜂草苷和蒙花苷的回收率，結(jié)果見表3-表8。

3結(jié)果及分析討論

3.1樣品測定

取不同廠家、不同批號的薄荷配方顆粒適量，研細(xì)，各取約 0.25 g，精密稱定，分別按照2.2項(xiàng)中制備供試品溶液，按照2.4項(xiàng)中色譜條件進(jìn)樣10 μL，測定咖啡酸、橙皮苷、迷迭香酸、香葉木苷、香蜂草苷和蒙花苷的含量，結(jié)果見表9。

3.2分析討論

本研究采用二極管陣列檢測器對6種指標(biāo)成分進(jìn)行200～400 nm全波長掃描，發(fā)現(xiàn)咖啡酸、迷迭香酸和蒙花苷在330 nm處均有較大紫外吸收，橙皮苷和香蜂草苷在284 nm處有較大吸收，香葉木苷在345 nm處有最大吸收，但是在此波長下香葉木苷與相鄰峰無法實(shí)現(xiàn)基線分離，在380 nm波長時(shí)香葉木苷仍有較大紫外吸收，而影響香葉木苷測定的干擾峰在此波長下無紫外吸收，因此選擇380 nm作為香葉木苷的檢測波長。

橙皮苷、迷迭香酸和香葉木苷3種成分的色譜峰保留時(shí)間較為接近，考察乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-5%乙酸、甲醇-乙腈-5%乙酸等多種流動(dòng)相系統(tǒng)，最終發(fā)現(xiàn)以甲醇-乙腈-5%冰乙酸作為流動(dòng)相，采用梯度洗脫，混合對照品溶液和供試品溶液中6種待測指標(biāo)成分色譜峰峰形均較好，分離度符合要求。

結(jié)果表明，不同廠家以及相同廠家不同批號的薄荷配方顆粒含量存在一定差異。造成此差異的因素很多，其中最重要的因素有2個(gè)：一為原料，二為生產(chǎn)工藝。有研究報(bào)道表明，部位、采收期、產(chǎn)地的不同均對薄荷藥材中有效成分的含量有不同程度的影響[23]。此外，不同廠家所采用的提取、干燥工藝不同也可能導(dǎo)致指標(biāo)成分的差異。制劑工藝主要影響薄荷中有效成分的溶出與轉(zhuǎn)化、輔料用量等。在薄荷標(biāo)準(zhǔn)湯劑的研究中發(fā)現(xiàn)，咖啡酸在標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的轉(zhuǎn)移率超過了150%，多批次薄荷標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品超過了200%。薄荷中迷迭香酸、丹酚酸等有機(jī)酸均含有咖啡酸的結(jié)構(gòu)，在煎煮過程中可能發(fā)生化合鍵的斷裂從而生成咖啡酸。有研究表明迷迭香酸的抗氧化能力強(qiáng)于咖啡酸[24]，因此為保證薄荷配方顆粒的質(zhì)量和臨床療效應(yīng)嚴(yán)格控制提取、濃縮等工藝條件。

4結(jié)語

薄荷配方顆粒中非揮發(fā)性成分是發(fā)揮藥效的重要成分，目前，采用高效液相色譜法同時(shí)測定薄荷配方顆粒中多種非揮發(fā)性成分的方法鮮有報(bào)道[11]。本實(shí)驗(yàn)通過對流動(dòng)相、檢測波長、提取方法等進(jìn)行考察，最終確定了采用 HPLC法同時(shí)測定薄荷配方顆粒中咖啡酸、橙皮苷、迷迭香酸、香葉木苷、香蜂草苷和蒙花苷6種成分的含量，以甲醇-乙腈-5%冰乙酸為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速為0.6 mL/min，柱溫為35 ℃，檢測波長分別為咖啡酸、迷迭香酸、蒙花苷采用330 nm，橙皮苷和香蜂草苷采用284 nm，香葉木苷采用380 nm。結(jié)果表明，咖啡酸、橙皮苷、迷迭香酸、香葉木苷、香蜂草苷和蒙花苷分別在0.39～7.70，1.24～24.72，1.94～38.71，0.63～12.56，0.35～7.06，1.45～29.00 mg/L呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r均大于0.999 7，各成分的平均回收率分別為99.19%，98.06%，100.45%，98.90%，100.17%，99.78%。該方法簡便快速、重復(fù)性好、專屬性強(qiáng)，可以為薄荷配方顆粒質(zhì)量的有效控制提供方法參考和科學(xué)依據(jù)。

薄荷中含有多種黃酮類和酚酸類成分，具有抗炎、抗氧化、抗菌和抗病毒等藥理作用，與其臨床療效密切相關(guān)。本文僅對薄荷配方顆粒中6種成分進(jìn)行了同時(shí)測定，未來應(yīng)繼續(xù)深入研究薄荷配方顆粒中的其他黃酮類和酚酸類成分。中藥指紋圖譜是一種全面反映中藥或中藥制劑整體性化學(xué)特征的質(zhì)量分析方法，被廣泛應(yīng)用于中藥及中藥制劑的質(zhì)量控制，而目前薄荷配方顆粒中多個(gè)色譜峰未能指認(rèn)，未來可以通過多成分含量測定和指紋圖譜相結(jié)合的方式全面控制薄荷配方顆粒的質(zhì)量。

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