劉青，田慧敏，邱一秀 ，朱立磊，宋元達(dá)

(1.山東理工大學(xué) 農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，山東 淄博 255049；2.山東玉兔食品股份有限公司，山東 淄博 255300)

丁酸(butyric acid)又名酪酸，是一種揮發(fā)性短鏈脂肪酸，天然丁酸主要由丁酸梭菌屬(Clostridium)、丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)、酪酸桿菌屬(Butyribacterium)、八聯(lián)球菌屬(Sarcina)和梭桿菌屬(Fusobacterium)等合成[1-2]。丁酸是人體大腸中產(chǎn)丁酸細(xì)菌的主要代謝產(chǎn)物，同時(shí)也是人腸道上皮細(xì)胞的主要營養(yǎng)物質(zhì)[3]。據(jù)報(bào)道，丁酸及其鹽類具有預(yù)防和治療結(jié)腸癌、腸道菌群紊亂、急慢性腹瀉、潰瘍性結(jié)腸炎以及血紅蛋白病等功能[3-5]，并可以間接輔助治療肝損傷[6]。近年來，丁酸及其衍生物在食品、藥品、飼料等方面的應(yīng)用逐漸被重視，具有良好的應(yīng)用前景[7-8]。

建立精確度高、重復(fù)性好的丁酸定量分析方法是富丁酸功能性食品研發(fā)的前提條件。食醋是人們生活中必不可少的調(diào)味品，食醋發(fā)酵過程中各種微生物的代謝活動(dòng)會(huì)產(chǎn)生種類豐富的有機(jī)酸，所以對(duì)人體有抗菌、抗癌、減肥、降壓、控制血糖等作用[9]，作為功能性食品已經(jīng)開發(fā)出蘋果醋、葡萄醋、苦蕎醋、柿子醋、紅棗醋、玫瑰醋等[10-17]多種產(chǎn)品。然而，由于普通食醋中丁酸含量極低，常常不被作為有機(jī)酸主要成分來測(cè)定，因此鮮有報(bào)道。目前高效液相色譜法(HPLC)和氣相色譜法(GC)是食醋中有機(jī)酸檢測(cè)最常用的方法[18-24]。丁酸作為小分子有機(jī)酸，只有4個(gè)碳原子，極性較大，利用高效液相分析時(shí)，在常用的C18反相柱上保留效果較差，樣品中雜峰較多時(shí)，需要提高相對(duì)保留值才能獲得較好分離度，然而這往往對(duì)色譜柱和泵的使用壽命有影響。此外，液相具有維護(hù)費(fèi)用高、流動(dòng)相配制復(fù)雜、有機(jī)試劑消耗量大的特點(diǎn)，分析成本較高。本研究利用氣相色譜對(duì)食醋中的丁酸含量進(jìn)行定量分析，對(duì)比3種不同預(yù)處理方法對(duì)食醋中丁酸提取效率的影響，旨在尋找一種最佳的預(yù)處理方法，為富丁酸食醋或其他功能性食品中丁酸的提取、分析及應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米醋、陳醋、香醋、小米醋和白醋從淄博當(dāng)?shù)爻匈徺I；富丁酸醋由本實(shí)驗(yàn)室制備。丁酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.5%)， 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、正己烷、二氯甲烷、乙醚均為色譜純，德國Meker公司；乙酸鋅、氯化鈉、高氯酸、氫氧化鈉、磷酸、硫酸、無水硫酸鈉、亞鐵氰化鉀等均為分析純，國藥集團(tuán)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 6890N氣相色譜儀(配有FID檢測(cè)器) ，美國安捷倫科技公司；DM-FFAP色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)， 迪馬科技；5810R型離心機(jī)，Eppendorf(艾本德)公司；LE3002E/02型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；QL-861型漩渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)櫥，淄博豪邁實(shí)驗(yàn)室裝備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 氣相色譜條件

色譜柱：DM-FFAP色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；升溫程序：初始溫度100 ℃保持1 min，以3 ℃/min的速度升至160 ℃，再以10 ℃/min的速度升至240 ℃保持5 min。進(jìn)樣口溫度250 ℃，檢測(cè)器溫度260 ℃；載氣為氮?dú)?，氮?dú)饬魉贋?0 mL/min，氫氣流速為60 mL/min，空氣流速為400 mL/min；進(jìn)樣量為1 μL。

1.3.2 乙醚萃取法

丁酸屬于揮發(fā)性小分子有機(jī)酸，極易溶于水，但在水中的絕對(duì)濃度相對(duì)較低，不易被檢測(cè)，因此本實(shí)驗(yàn)選用極性較強(qiáng)的乙醚作為提取溶劑。準(zhǔn)確量取5 mL醋樣于50 mL離心管中，加入5 mL純水、1 mL 10.6%亞鐵氰化鉀溶液和1 mL 30%乙酸鋅溶液，充分渦旋振蕩后靜置5 min，4 000 r/min離心5 min；然后將上清液轉(zhuǎn)移至100 mL分液漏斗，加入20 mL乙醚，充分振蕩后靜置，收集乙醚層，剩余水層用20 mL乙醚分別提取兩次，合并乙醚相于200 mL旋蒸瓶中，30 ℃減壓旋蒸至剩余1 mL左右，轉(zhuǎn)移濃縮液，加少量純乙醚清洗旋蒸瓶壁，將清洗液與濃縮液合并，用乙醚定容至2 mL。待測(cè)液用0.22 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)樣。

1.3.3 甲酯化-正己烷法

甲酯化是廣泛應(yīng)用于有機(jī)酸的衍生化方法，因?yàn)橛袡C(jī)酸的極性很強(qiáng)且熱穩(wěn)定性又較低，所以通常要將這些酸轉(zhuǎn)化為弱極性的酯類衍生物，以增大揮發(fā)性及熱穩(wěn)定性，便于進(jìn)行氣相色譜分析。本方法在林楊[25]方法的基礎(chǔ)上有所改進(jìn)，分別取2 mL醋樣于10 mL的離心管中，再加入1 mL 10.6%亞鐵氰化鉀溶液和1 mL 30%乙酸鋅溶液，搖勻后靜置5 min，4 000 r/min離心5 min。收集上清液并定容至5 mL，取1 mL于具塞試管中，加入250 μL 5 mol/L的磷酸溶液，混勻2 min，加入1.5 mL 1%的硫酸-甲醇溶液，充分混勻后70 ℃水浴6 h，取出冷卻至室溫，加1 mL正己烷混勻后靜置分層，取0.6 mL正己烷層過0.22 μm微孔濾膜后進(jìn)樣。

1.3.4 甲酯化-二氯甲烷法

本方法在謝文明等[26]方法的基礎(chǔ)上有所改進(jìn)，分別取2 mL醋樣于10 mL的離心管中，再加入1 mL 10.6%亞鐵氰化鉀溶液和1 mL 30%乙酸鋅溶液，搖勻后靜置5 min，4 000 r/min離心5 min。將上清液全部轉(zhuǎn)移至離心管中，加1 mL 12.5%硫酸-甲醇溶液，充分混勻后60 ℃水浴4 h，取出冷卻至室溫，加入2 mL二氯甲烷，渦旋混勻3 min，4 000 r/min離心5 min；收集二氯甲烷層，重復(fù)萃取2次，合并二氯甲烷提取液并定容至6 mL，加入1.5 mL飽和NaCl，充分混勻后靜置分層，取1 mL二氯甲烷層，用0.22 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)樣。

1.3.5 富丁酸醋的制備

將加入了500 g大米和2 000 mL蒸餾水的發(fā)酵罐置于72 ℃恒溫水浴中，加入7 g α-淀粉酶，水解2 h，自然冷卻至室溫。將丁酸梭菌(Clostridium butyricum)的種子培養(yǎng)液按3%的接種量轉(zhuǎn)接到大米水解液中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)酵24 h；丁酸發(fā)酵結(jié)束后，將浸泡好的烏衣紅曲加入到發(fā)酵罐內(nèi)，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵15 d后，將酒醅離心，取每100 mL上清液分裝在三角瓶成為醋酸發(fā)酵液。將醋酸菌種(滬釀 1.01)按照 3%的接種量接入三角瓶，進(jìn)行搖床培養(yǎng)(28 ℃，180 r/min)。發(fā)酵6 d后取出，將富丁酸醋置于高溫滅菌鍋進(jìn)行121 ℃、30 min滅菌，得到富丁酸醋。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本研究利用外標(biāo)法定量，利用 Microsoft Excel 2017軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，利用 SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，利用Origin 8.5軟件進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 保留時(shí)間和峰形的測(cè)定結(jié)果

將丁酸標(biāo)準(zhǔn)品按照3種預(yù)處理方法進(jìn)行提取，經(jīng)過氣相色譜測(cè)定，得到標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖如圖1所示。3種預(yù)處理方法處理后的目標(biāo)物保留時(shí)間分別為9.20、9.25、9.50 min，保留時(shí)間附近均沒有其他雜峰干擾。圖1(a)為用乙醚萃取處理后得到的丁酸峰，其響應(yīng)值較高，峰型也較好；圖1(b)為利用1%硫酸-甲醇溶液甲酯化后，用正己烷萃取得到的色譜圖，其丁酸的響應(yīng)值明顯低于其他兩種方法；圖1(c)為12.5%硫酸-甲醇溶液甲酯化后，用二氯甲烷萃取得到的色譜圖，其丁酸的響應(yīng)值最高，保留時(shí)間最長(zhǎng)。甲酯化后的丁酸保留時(shí)間與乙醚萃取的丁酸保留時(shí)間有所不同，比較兩種甲酯化方法發(fā)現(xiàn)，利用12.5%硫酸-甲醇溶液甲酯化后，用二氯甲烷萃取得到的丁酸甲酯保留效果較好，可能因?yàn)槎∷嶙鳛榈吞兼溣袡C(jī)酸極性相對(duì)較大、二氯甲烷較之正己烷極性也較大，因此甲酯化后利用二氯甲烷萃取在FFAP色譜柱上也有較好的峰形和保留。

(a)經(jīng)乙醚萃取法處理

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、檢出限和檢測(cè)限的測(cè)定結(jié)果

將丁酸標(biāo)準(zhǔn)品按照不同濃度梯度稀釋后，分別按照3種不同方法進(jìn)行預(yù)處理，經(jīng)氣相色譜分析，根據(jù)結(jié)果繪制得到3條標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)信噪比(S/N)確定檢測(cè)限(RSN = 10)和檢出限(RSN = 3)。如表1所示，不同方法處理后的標(biāo)準(zhǔn)品均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)范圍為0.999 2～0.999 8，檢測(cè)限范圍為0.016～0.177 mg/mL，檢出限為0.005～0.072 mg/mL。其中，乙醚萃取法的檢出限和檢測(cè)限最低，而甲酯化-正己烷法的最高。這是由于乙醚萃取法是直接用乙醚進(jìn)行提取，步驟簡(jiǎn)單，過程中損失較少；而甲酯化的方法都相對(duì)復(fù)雜，過程中轉(zhuǎn)移步驟較多，會(huì)造成一定的損失。但是，乙醚揮發(fā)性強(qiáng)，在提取過程中不易控制，結(jié)果穩(wěn)定性較差。

表1 不同方法處理后丁酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢測(cè)限和檢出限

2.3 回收率和精確度的測(cè)定結(jié)果

向已知丁酸濃度的食醋樣品中分別加入質(zhì)量濃度為0.46、0.87、2.25 mg/mL的丁酸標(biāo)準(zhǔn)品，將加標(biāo)后的樣品分別按照3 種不同提取方法進(jìn)行預(yù)處理。每個(gè)加標(biāo)平行6次，回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見表2。由表2可知，乙醚萃取法的回收率范圍為58.69%～112.45%，平均回收率為85.57%，其中白醋回收率最高，可能是由于白醋的成分與其他醋相比較簡(jiǎn)單，提取時(shí)干擾物相對(duì)較少。甲酯化-正己烷法和甲酯化-二氯甲烷法的回收率范圍分別為71.26%～111.49%和87.36%～106.52%，平均回收率分別為91.38%和96.94%。乙醚萃取法的回收率不穩(wěn)定，這與不同樣品屬性有關(guān)；同時(shí)，因?yàn)橐颐讶菀讚]發(fā)，重復(fù)性難以控制，所以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.54%～4.87%之間。兩種甲酯化方法與乙醚萃取法相比回收率高且相對(duì)穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍分別為0.23%～3.49%和0.24%～4.31%。而且，食醋的發(fā)酵過程復(fù)雜，產(chǎn)生的丁酸可能與其他代謝產(chǎn)物反應(yīng)，而不是以游離的丁酸存在；因此，即使乙醚萃取法的檢測(cè)限最低，但在實(shí)際測(cè)定中，可能還會(huì)遺漏部分丁酸含量，使準(zhǔn)確度相對(duì)較低。從兩種甲酯化方法得到的結(jié)果來看，甲酯化-二氯甲烷法的回收率范圍更接近100%，平均回收率也更高，這可能與硫酸-甲醇溶液中硫酸的含量有關(guān)。王韋崗等[27]利用硫酸-甲醇溶液對(duì)食品中常見的12種有機(jī)酸進(jìn)行衍生，并通過氣相色譜法對(duì)衍生物進(jìn)行測(cè)定，考察了不同體積分?jǐn)?shù)的硫酸-甲醇溶液對(duì)衍生效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)包括丁酸在內(nèi)的12種有機(jī)酸衍生物的峰面積與硫酸-甲醇溶液的體積分?jǐn)?shù)成正比，此結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)論一致。

表2 不同方法處理后5種食醋樣品中的丁酸回收率和精確度 (n=6)

2.4 樣品分析

食醋發(fā)酵分為多個(gè)階段，其中丁酸發(fā)酵階段是本實(shí)驗(yàn)室釀制富丁酸醋的特殊環(huán)節(jié)，因此考察此過程中丁酸含量的變化對(duì)發(fā)酵工藝的控制和優(yōu)化有著至關(guān)重要的作用。本研究采用甲酯化-二氯甲烷法對(duì)發(fā)酵醪中的丁酸進(jìn)行萃取，利用氣相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，在10 d的發(fā)酵期間，富丁酸醋中丁酸含量整體呈上升趨勢(shì)，在第8 d后趨于平緩。丁酸含量變化范圍為1.31～2.36 mg/mL，對(duì)照組(并未接種丁酸菌)為0.051～0.109 mg/mL。王貴雙等[28]通過對(duì)釀造、配制食醋和固態(tài)、液態(tài)發(fā)酵食醋各有機(jī)酸的百分含量進(jìn)行分析得出：釀造食醋中有機(jī)酸含量從高到低分別為乙酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、甲酸、丙酮酸、草酸和丙酸；配制食醋中有機(jī)酸含量從高到低分別為乙酸、乳酸、檸檬酸、甲酸、丙酸、琥珀酸、丙酮酸和草酸；固、液態(tài)發(fā)酵食醋中有機(jī)酸含量從高到低的順序與釀造食醋的順序相同。可見在大多數(shù)食醋中自然產(chǎn)生的丁酸含量極其少，因此富丁酸食醋的開發(fā)對(duì)于豐富功能性保健食醋的種類具有重要意義。

圖2 富丁酸醋發(fā)酵醪中丁酸的含量變化

3 結(jié)束語

本實(shí)驗(yàn)采用3種不同的方法處理5種食醋，利用氣相色譜法檢測(cè)食醋中的丁酸，通過對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的分析發(fā)現(xiàn)，不同的預(yù)處理方法對(duì)檢測(cè)食醋中丁酸的含量會(huì)產(chǎn)生不同的影響，12.5%硫酸甲醇溶液甲酯化與二氯甲烷萃取結(jié)合的方法是最適合檢測(cè)丁酸的預(yù)處理方法。

乙醚萃取法操作簡(jiǎn)單，氣相色譜圖中有機(jī)酸的分離度高、峰型較好且響應(yīng)度較高，但由于乙醚的揮發(fā)性，導(dǎo)致氣相分析的結(jié)果不穩(wěn)定，加標(biāo)回收率在58.69%～112.45%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的范圍為0.54%～4.87%，準(zhǔn)確度較低；1%硫酸-甲醇甲酯化與正己烷萃取結(jié)合法，結(jié)果比較穩(wěn)定，加標(biāo)回收率在71.26%～111.49%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，在0.23%～ 3.49%之間，但色譜圖的峰型差、有拖尾現(xiàn)象且響應(yīng)值很低，對(duì)色譜柱會(huì)造成損害，其操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)；12.5%硫酸-甲醇溶液甲酯化與二氯甲烷萃取結(jié)合法，操作雖然稍微復(fù)雜且耗時(shí)較長(zhǎng)，但氣相分析的結(jié)果最理想，有機(jī)酸的分離度較高，丁酸峰型最好，無拖尾現(xiàn)象，響應(yīng)值也最高，而且回收率最穩(wěn)定，在87.36%～106.52%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.24%～4.31%之間。綜合以上分析，用12.5%硫酸-甲醇溶液甲酯化后再用二氯甲烷萃取的方法是最適合氣相檢測(cè)食醋中丁酸含量的方法。