劉含,曹慧,徐斐,袁敏,葉泰,于勁松,黎燕,陰鳳琴,吳秀秀,郝麗玲

(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院,上海,200093)

抗凍蛋白(antifreeze proteins,AFPs) 是生物為適應(yīng)極端寒冷環(huán)境而產(chǎn)生的一類特異性糖肽或多肽[1],它能夠以非依數(shù)的形式降低溶液的冰點(diǎn)而不改變其熔點(diǎn),從而導(dǎo)致溶液的熔點(diǎn)和冰點(diǎn)之間出現(xiàn)差值,這種差值稱為熱滯活性[1-2]。AFPs還可通過氫鍵吸附于冰晶表面,從而控制冰晶生長以及抑制冰晶之間發(fā)生重結(jié)晶。AFPs的熱滯活性及重結(jié)晶抑制活性使得其能減少或防止在凍融循環(huán)過程中冰晶對(duì)細(xì)胞和組織的傷害,并在結(jié)冰或亞結(jié)冰條件下保護(hù)生物體不受傷害[3],因而在食品、血液以及器官和組織的冷凍儲(chǔ)存中有廣泛的應(yīng)用前景[4]。

迄今為止,人們?cè)谥参?、海洋魚類、昆蟲及真菌中都發(fā)現(xiàn)了不同類型的AFPs[5-6],但成本高、產(chǎn)率低等不足仍是限制AFPs產(chǎn)業(yè)化制備的主要因素,因而尋找合適的AFPs原料并提取出高熱滯活性的AFPs是亟需解決的問題。動(dòng)物皮是膠原蛋白的主要載體,從膠原蛋白的特異性氨基酸序列及空間結(jié)構(gòu)分析,膠原蛋白可能含有高活性的膠原抗凍肽[7]。我國具有豐富的牦牛資源,牦牛皮中膠原蛋白的含量達(dá)到其干重的70%以上。但目前牦牛皮主要應(yīng)用于皮革的制作,利用率較低。因而利用牦牛皮作為提取AFPs的原料不僅可以有效利用畜禽加工副產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)價(jià)值增值的目的,還能滿足市場(chǎng)對(duì)高性價(jià)比AFPs的需求。

膠原抗凍肽的分子質(zhì)量對(duì)其抗凍特性有著顯著影響。BAR DOLEV等[8]研究發(fā)現(xiàn)南極細(xì)菌Marinomonasprimoryensis能分泌具有附著性的AFP1,使細(xì)菌附著在冰頂部以獲得氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)。該AFP是1種由 5 個(gè)不同區(qū)域組成的長蛋白質(zhì),相對(duì)分子質(zhì)量 1.5 MDa,其中第4個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為 34 kDa的特定區(qū)域能與冰晶發(fā)生特異性的結(jié)合。DAMODARAN等[9]利用蛋白酶水解魚皮明膠,證實(shí)了分子質(zhì)量在1 000～2 500 Da的明膠多肽具有抑制冰晶生長的作用。這些實(shí)驗(yàn)表明了不同分子質(zhì)量的抗凍肽抑制冰晶生長的能力并不相同,但目前對(duì)不同分子質(zhì)量的膠原抗凍肽抑制冰晶生長作用機(jī)理的研究卻很少。因此本實(shí)驗(yàn)采用熱水抽提耦合酶水解法,制備了膠原蛋白酶解產(chǎn)物,并應(yīng)用超濾膜技術(shù)得到了<1 k、1～3 k、3～5 k及>5 kDa這4種不同分子質(zhì)量的膠原抗凍肽。在此基礎(chǔ)上,對(duì)不同分子質(zhì)量范圍膠原抗凍肽的熱滯活性、重結(jié)晶抑制能力及修飾冰晶生長的特性進(jìn)行了研究,同時(shí)總結(jié)了膠原抗凍肽與冰晶相互作用的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

新鮮牦牛皮,青海省屠宰場(chǎng)。將牦牛皮去毛、洗凈、絞碎,并采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的 Na2CO3溶液脫脂18 h,進(jìn)一步采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaCl溶液去除鹽溶性非膠原成分,蒸餾水漂洗后貯藏于-20 ℃?zhèn)溆?；牛血清白蛋?bovine serum albumin,BSA),上海伯奧生物科技有限公司；木瓜蛋白酶(200 NFU/mg),南寧龐博公司；其余試劑均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Pyris Diamond差示掃描量熱儀，美國Perkin Elmer 公司；RO-UF-4010(MSM-1812)型膜分離裝置超濾納濾反滲透，1 kDa、3 kDa、5 kDa等0.2 m2卷式膜組件，上海摩速科學(xué)器材有限公司；BP211D型天平，德國賽多利斯公司 (精確到0.01 mg) ； J-20XP型冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；BX51顯微鏡，日本奧林巴斯公司；FDCS冷熱臺(tái)，英國LinKam公司；Waters2414示差折光檢測(cè)器，美國沃特斯公司；Kje ltec 8400型全自動(dòng)凱氏定氮儀, 丹麥福斯集團(tuán)公司；LD85B3型真空冷凍干燥機(jī)，美國MillRock科技公司；TLID-2005袖珍型低溫恒溫槽，金壇市華峰儀器有限公司；Agilent1100型氨基酸自動(dòng)分析儀，美國Agilent公司；79-1恒溫磁力攪拌器，寧波天恒儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 牦牛皮常規(guī)成分的測(cè)定

牦牛皮中的水分含量采用常壓干燥法測(cè)定(GB 5009.3—2016);粗蛋白含量采用微量凱氏定氮法測(cè)定(GB 5009.5—2016);粗脂肪含量采用索氏抽提法測(cè)定(GB 5009.6—2016)。

1.3.2 牦牛皮中膠原蛋白的提取

稱取20 g牦牛皮置于燒杯中,以1∶30的料液比(g∶mL)添加蒸餾水,在微沸狀態(tài)下加熱5 h,待溶液冷卻至室溫后置于酶反應(yīng)器內(nèi)。參考WANG等[10]的方法,并通過預(yù)實(shí)驗(yàn)得到膠原蛋白的最佳酶解條件為：木瓜蛋白酶添加量2 000 U/g,溫度55 ℃,酶解時(shí)間48 h。酶解完成后5 000 r/min離心30 min,取上清液測(cè)定羥脯氨酸(Hyp)含量。

1.3.3 膠原蛋白含量測(cè)定

膠原蛋白含量采用WOESSNER[11]的方法進(jìn)行測(cè)定。稱取4 g牦牛皮,加入30 mL 3 mol/L HCl 溶液于105 ℃下水解 16 h,水解完畢后過濾,獲得上清液。取4 mL稀釋好的上清液于比色管中,加入2 mL 14.1 g/mL氯胺T溶液,充分混勻后置于室溫下放置20 min以氧化Hyp；再加入2 mL顯色劑(10 g對(duì)二氨基苯甲醛,35 mL高氯酸,65 mL異丙醇,臨用前配制),并于60 ℃水浴加熱20 min；反應(yīng)完畢后,在波長 560 nm 處測(cè)定溶液的吸光值,并建立Hyp標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式和樣品吸光值計(jì)算膠原蛋白中Hyp 的含量，如公式(1)所示，膠原蛋白含量按公式(2)計(jì)算:

(1)

膠原蛋白含量/%=Hyp含量×7.46

(2)

式中：7.46為換算系數(shù)。

1.3.4 氨基酸組成

分別稱取10 mg不同分子質(zhì)量的膠原抗凍肽于水解管中,加入2 mL 6 mol/L HCl溶液,再加入3～4滴苯酚；將水解管放入冰鹽水中預(yù)冷3～5 min,抽真空并封口,然后在110 ℃下水解 22 h；將水解后的樣品液轉(zhuǎn)移后過濾后轉(zhuǎn)移至量瓶內(nèi),用水定容至刻度，振蕩混勻。取1 mL濾液用氮吹儀60 ℃吹干,殘留物用檸檬酸鈉緩沖液復(fù)溶后取樣上機(jī)測(cè)定。色譜條件：C18柱(4.0 mm×125 mm)；柱溫40 ℃；樣品流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長440 nm(Hyp、Pro),570 nm(除Hyp、Pro以外的氨基酸)；流動(dòng)相A為20 mmol醋酸鈉溶液,B為V(20 mmol醋酸鈉溶液)∶V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶2∶2。

1.3.5 膠原酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布的測(cè)定

采用水相凝膠滲透色譜法對(duì)酶解液中的多肽進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量分布的測(cè)定。色譜條件：Waters2414示差折光檢測(cè)器；Waters凝膠色譜柱；流動(dòng)相為0.1 mol/L的NaNO3溶液；流速0.5 mL/min；柱溫40 ℃。酶解液凍干粉配成5 mg/mL的溶液,進(jìn)樣體積50 μL。

1.3.6 膠原蛋白酶解液的膜分離處理及得率計(jì)算

圖1 不同分子質(zhì)量膠原抗凍肽制備工藝流程圖Fig.1 Preparation process of collagen antifreeze peptides with different molecular weights

膜分離設(shè)備的參數(shù)：壓力0.2 MPa,溫度25 ℃。根據(jù)1.3.3中的方法測(cè)定不同組分超濾液中膠原蛋白的含量,并根據(jù)公式(3)計(jì)算其得率:

(3)

式中：m1，膜分離后一定分子質(zhì)量范圍內(nèi)的膠原抗凍肽總質(zhì)量，g；m2，牦牛皮的總質(zhì)量，g。

1.3.7 不同分子質(zhì)量膠原抗凍肽的熱滯活性測(cè)定

稱取約10 mg樣品密封于鋁皿內(nèi),并放置于差示掃描量熱議內(nèi)。當(dāng)儀器充滿液氮并穩(wěn)定后,以10 ℃/min的速率將樣品降溫至-20 ℃并保持5 min；然后以5 ℃/min的速率升溫至樣品呈固液共存狀態(tài),即到達(dá)其保留溫度(holding temperature,Th),保持5 min；再將溫度以1 ℃/min的速率從Th降至-20 ℃。重復(fù)上述升降溫程序,分別記錄樣品的起始結(jié)晶溫度(T0)以及結(jié)晶熱(ΔHr)[9],并分別按照公式(4)計(jì)算熱滯活性值。以無抗凍活性的BSA作為對(duì)照。

熱滯活性=Th-T0

(4)

1.3.8 不同分子質(zhì)量膠原抗凍肽的重結(jié)晶抑制效應(yīng)

以質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%的蔗糖溶液為溶劑,配制質(zhì)量濃度100 mg/mL的抗凍肽溶液,利用低溫顯微鏡觀察其重結(jié)晶抑制能力。首先以10 ℃/min的速率將樣品溫度從25 ℃降至1 ℃,保持1 min以防止表面起霧；然后以90 ℃/min的速率降溫至-50 ℃以生成微小的冰晶,保持1 min；再以10 ℃/min的速率升溫至-6 ℃,保持40 min[12]；圖像收集和分析由軟件IMAGE-PRO PLUS完成,圖像放大倍數(shù)為500倍。

1.3.9 不同分子質(zhì)量膠原抗凍肽對(duì)冰晶生長形態(tài)的修飾

以40%的蔗糖溶液為溶劑,將制得的抗凍肽配制成100 mg/mL的溶液,并利用低溫顯微鏡觀察其對(duì)冰晶生長形態(tài)的影響。首先以10 ℃/min的速率將溫度從25 ℃降至-30 ℃,生成微小的冰晶,保溫1 min；然后以4 ℃/min的速率升溫,直至出現(xiàn)單冰晶,再以0.1 ℃/min的速率降溫,使冰晶生長[12]。圖像放大倍數(shù)為500倍,圖像收集和分析由軟件IMAGE-PRO PLUS完成,通過計(jì)算冰晶面積,評(píng)估添加不同分子質(zhì)量抗凍肽的冰晶面積與降溫時(shí)間的關(guān)系。

2）在設(shè)計(jì)注水系統(tǒng)單站停運(yùn)運(yùn)行方案時(shí)，不僅要從下游注水井的壓力和水量需求分析，同時(shí)還要考慮上游污水系統(tǒng)調(diào)運(yùn)的水量和水質(zhì)是否能夠滿足注入系統(tǒng)要求。

2 結(jié)果與討論

2.1 牦牛皮的主要成分

牦牛皮的主要成分含量如表1所示。牦牛皮中水分含量最高,達(dá)到64.87%。除水分外,牦牛皮中蛋白質(zhì)的含量達(dá)到28.17%,占干重質(zhì)量的80.19%。牦牛皮中的蛋白主要為膠原蛋白,占總蛋白含量的91.91%。而豬皮、鵝皮和魚皮等動(dòng)物皮中不僅總蛋白含量低于牦牛皮,膠原蛋白含量也僅占總蛋白含量的65%～85%[13-15],由此可見牦牛皮中膠原蛋白的含量十分豐富。

表1 牦牛皮的主要成分Table 1 Main ingredients of yak hide

2.2 不同分子質(zhì)量膠原抗凍肽的得率及分子質(zhì)量分布

經(jīng)過膜分離后,不同分子質(zhì)量膠原肽的得率如表2所示?？梢?熱水耦合酶水解法對(duì)膠原肽的得率可達(dá)77%。其中,對(duì)小分子質(zhì)量(<1 kDa)膠原肽的得率最高,為61.6%,其余依次為3～5 kDa、>5 kDa和1～3 kDa的膠原肽。不同分子質(zhì)量膠原肽的分子質(zhì)量分布如圖2所示,可見其主要為<1 kDa的膠原肽。

表2 不同分子質(zhì)量膠原抗凍肽的得率Table 2 Contents of different peptides of collagen antifreeze peptide

圖2 不同分子質(zhì)量膠原抗凍肽的分子質(zhì)量分布圖Fig.2 Molecular weight distribution of collagen antifreeze peptides with different molecular weights

2.3 不同分子質(zhì)量膠原抗凍肽的氨基酸組成

采用氨基酸自動(dòng)分析儀分析了不同分子質(zhì)量膠原肽的氨基酸組成,結(jié)果如表3所示。在不同分子質(zhì)量膠原肽的氨基酸組成中,甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)和Hyp含量較高,其中,Gly幾乎占了1/3,Pro含量約占9.6%～10.6%,Hyp含量約占3.4%～5.5%,為典型的膠原蛋白的氨基酸組成模式。膠原蛋白的氨基酸序列通常被描述為-(Gly-X-Y)n-,其中X通常為Pro或Hyp[9]。這一重復(fù)序列與GRAHAM等[16]從雪蚤中提取的AFP的重復(fù)序列-Gly-X-X-非常相似。

表3 不同分子質(zhì)量膠原抗凍肽的氨基酸組成 單位:個(gè)/1 000個(gè)殘基

在4種不同分子質(zhì)量的膠原肽中,<1 kDa和>5 kDa膠原肽的Hyp含量顯著高于其他分子質(zhì)量的膠原多肽,分別達(dá)到5.5%和4.8%。已有研究發(fā)現(xiàn)，Hyp具有親水性,可通過羥基與冰晶棱面結(jié)合,從而抑制冰晶的生長,因而其對(duì)冰晶的重結(jié)晶抑制效應(yīng)有顯著影響[17]。4種不同分子質(zhì)量膠原肽中高含量的脯氨酸殘基的烷基側(cè)鏈可提供非極性環(huán)境從而起到穩(wěn)定氫鍵的作用[7]。

2.4 不同分子質(zhì)量膠原抗凍肽的熱滯活性

以無抗凍活性的BSA為對(duì)照,采用差示掃描量熱法測(cè)定了不同分子質(zhì)量膠原抗凍肽的熱滯活性,結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同分子質(zhì)量膠原抗凍肽的熱滯活性Fig.3 Thermal hysteresis activity of collagen antifreeze peptides with different molecular weights

相比較于無抗凍活性的BSA,1～3 kDa和3～5 kDa膠原抗凍肽的結(jié)晶峰出現(xiàn)明顯延遲,熱滯活性值分別達(dá)到2.66和5.77 ℃。<1 kDa和>5 kDa的膠原抗凍肽表現(xiàn)出輕微的熱滯活性,分別為0.05 和0.92 ℃。熱滯活性較高的1～3 kDa和3～5 kDa膠原抗凍肽的氨基酸組成中Hyp具有較低的比例,這與之前文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[18]。AFPs可分為“中等活躍”AFPs和“超級(jí)活躍”AFPs,“中等活躍”的AFPs可以使冰點(diǎn)降低不超過1 ℃,與冰晶的相互作用僅限于特定的非基底面；而“超級(jí)活躍”的AFPs可以結(jié)合多個(gè)冰晶面,甚至可使冰點(diǎn)下降3～6 ℃[19]。所以<1 kDa、>5 kDa的膠原抗凍肽可被歸類為中等活躍AFPs,1～3 kDa、3～5 kDa的膠原抗凍肽可被歸類為超級(jí)活躍AFPs。

2.5 不同分子質(zhì)量膠原抗凍肽的重結(jié)晶抑制作用

以40%的蔗糖溶液為空白對(duì)照,利用低溫顯微鏡觀察了不同分子質(zhì)量抗凍肽的重結(jié)晶抑制作用,冰晶在-50 ℃和-6 ℃保持40 min的狀態(tài)如圖4所示。

a～e-40%蔗糖；f～j-<1 kDa的多肽；k～o-1～3 kDa的多肽；p～t-3～5 kDa的多肽；u～y->5 kDa的多肽圖4 不同分子質(zhì)量膠原抗凍肽的重結(jié)晶抑制活性Fig.4 Recrystallization inhibition activity of collagen antifreeze peptides with different molecular weights

在樣品溶液從室溫降溫至-50 ℃的過程中,樣品由液體狀態(tài)轉(zhuǎn)變成由多個(gè)單冰晶緊密結(jié)合組成的固體狀態(tài),此時(shí)顯微形貌變暗(圖4-a)。隨著樣品溫度從-50 ℃緩慢增加至-6 ℃,部分冰晶融化形成彌散狀態(tài)(圖4-b)。繼續(xù)在-6 ℃保持40 min后,冰晶發(fā)生了重結(jié)晶現(xiàn)象,主要有融化與消失收縮、保持相對(duì)圓形均勻生長和多個(gè)小冰晶合并成較大的冰粒[20-22]等3種不同的形式。膠原抗凍肽的添加顯著抑制了冰晶的重結(jié)晶,不同樣品抑制重結(jié)晶的程度也出現(xiàn)了顯著的差異。在40%的蔗糖溶液中形成的典型圓形冰晶,隨著在-6 ℃保溫時(shí)間的延長,仍呈圓形均勻生長,但冰晶顆粒的平均尺寸顯著高于添加膠原抗凍肽的冰晶；添加<1 kDa和>5 kDa 膠原抗凍肽的樣品在-6 ℃保溫40 min后,其冰晶數(shù)量及尺寸沒有發(fā)生顯著變化,冰晶形狀多呈有棱角狀和拉長型；而添加1～3 kDa和3～5 kDa膠原抗凍肽樣品中的冰晶在-6 ℃保溫40 min后,部分冰晶融化和消失導(dǎo)致冰晶數(shù)量減少,冰晶形狀包括圓形、有棱角型、拉長型,其中圓形占有較大比例?？梢?<1 kDa和>5 kDa的膠原抗凍肽表現(xiàn)出了更好的重結(jié)晶抑制活性,這可能與<1 kDa和>5 kDa的膠原抗凍肽具有較高含量的Hyp有關(guān)。1～3 kDa和3～5 kDa的膠原抗凍肽雖具有較高的熱滯活性,但抑制重結(jié)晶活性的效果并不佳,表明熱滯活性與重結(jié)晶抑制活性并不呈正相關(guān),這與YU等[23]的研究結(jié)果一致。

膠原抗凍肽結(jié)合于冰晶表面的特定區(qū)域進(jìn)而抑制了這些方向晶體的生長,這可以作為解釋冰晶形態(tài)發(fā)生變化的原因。膠原抗凍肽抑制冰晶重結(jié)晶的機(jī)理則可以通過“石頭壓海綿”模型來進(jìn)行解釋。如圖5所示,白色圓圈代表AFPs,大面積的黑色部分代表冰晶,黑色小點(diǎn)代表游離的水。在冰晶重結(jié)晶過程中,AFPs附著在冰晶表面,好像“石頭”壓在“海綿”上,從而阻礙了冰晶平滑曲面的生長,游離的水只能凍結(jié)/附著在AFPs附著點(diǎn)之間的冰晶上,冰晶在AFPs附著點(diǎn)之間的位置凸起生長,使冰晶表面彎曲造成局部表面的曲率變大,進(jìn)而通過Gibbs-Thompson效應(yīng)或Kelvin效應(yīng)降低冰晶的局部冰點(diǎn),晶體停止生長[24-25]。

圖5 AFPs抑制重結(jié)晶機(jī)理圖Fig.5 Mechanism of AFPs inhibiting recrystallization

2.6 不同分子質(zhì)量膠原抗凍肽對(duì)單冰晶生長形態(tài)的修飾效應(yīng)

以40%的蔗糖溶液為空白對(duì)照,利用低溫顯微鏡觀察了不同分子質(zhì)量膠原抗凍肽修飾單冰晶生長的作用,結(jié)果如圖6所示。

a～d-40%蔗糖；e～h-<1 kDa的多肽；i～l-1～3 kDa的多肽；m～p-3～5 kDa的多肽；q～t->5 kDa的多肽圖6 不同分子質(zhì)量膠原抗凍肽對(duì)單冰晶生長形態(tài)的修飾作用Fig.6 Effects of collagen antifreeze peptides with different molecular weights on growth morphology of single ice crystals

由圖6可見,隨著樣品溫度的緩慢降低,40%蔗糖溶液中的冰晶始終保持圓形的形態(tài),冰晶面積迅速生長擴(kuò)大(圖6-a～圖6-d)；而添加了膠原抗凍肽的樣品中(圖6-e～圖6-t),冰晶最初以六角型生長,在經(jīng)過冰點(diǎn)時(shí),冰晶在6個(gè)方向上迅速生長“爆裂”,其中<1 kDa和>5 kDa膠原抗凍肽導(dǎo)致冰晶呈六角星型擴(kuò)張,而1～3 kDa和3～5 kDa膠原抗凍肽導(dǎo)致冰晶呈樹突狀擴(kuò)張[26]。添加不同分子質(zhì)量膠原抗凍肽的冰晶在經(jīng)過冰點(diǎn)溫度時(shí)出現(xiàn)的形狀差異是其熱滯活性的顯著差別導(dǎo)致的。<1 kDa和>5 kDa的膠原抗凍肽為中等活躍的AFPs,會(huì)導(dǎo)致冰晶沿平行于c軸的方向爆發(fā),而1～3 kDa和3～5 kDa的膠原抗凍肽為高度活躍的AFPs,會(huì)導(dǎo)致冰晶垂直于c軸爆發(fā)。在昆蟲[12]和細(xì)菌[27]的AFPs中可以觀察到類似的冰晶生長模式。

采用IMAGE-PRO PLUS軟件計(jì)算了不同分子質(zhì)量膠原抗凍肽溶液中單個(gè)冰晶在緩慢降溫時(shí)的生長面積值(μm2)與時(shí)間(s)的關(guān)系,它們的斜率表示冰晶的生長速率。由圖7可見,40%蔗糖、<1 kDa、1～3 kDa、3～5 kDa和>5 kDa膠原抗凍肽溶液中的冰晶面積隨著時(shí)間生長的斜率值分別為395.36、185.82、266.42、149.50和180.60 μm2/s。很顯然,3～5 kDa膠原抗凍肽溶液中冰晶生長的斜率值最低,表明添加3～5 kDa的膠原抗凍肽能夠顯著延緩冰晶的生長。這可能是由于3～5 kDa膠原抗凍肽具有最高的熱滯活性,其與冰晶的多個(gè)平面,包括基底面都具有較強(qiáng)的親和力,從而能夠更均勻地與整個(gè)冰面結(jié)合,進(jìn)而抑制冰晶的生長。

圖7 不同分子質(zhì)量膠原抗凍肽對(duì)單個(gè)冰晶生長速率的影響Fig.7 Effect of antifreeze peptides with different molecular weights on growth rate of individual ice crystals

膠原抗凍肽的-Gly-X-Y-重復(fù)序列中存在分子質(zhì)量較小的氨基酸殘基,由于沒有構(gòu)象/空間約束,這些氨基酸殘基中的羰基氧原子可與冰核中的氧-氧鍵在同一個(gè)肽平面上排列。冰核中2個(gè)氧原子之間距離為4.52 ?,與三肽重復(fù)序列中氧原子距離4.538 ?十分接近,因此肽鏈中形成的氧平面可通過氫鍵相互作用與冰晶表面形成互補(bǔ)的結(jié)構(gòu),使膠原抗凍肽吸附在冰晶表面[28-29]。冰面在膠原抗凍肽吸附點(diǎn)之間的位置生長,造成表面曲率增加進(jìn)而引起平衡蒸氣壓的移動(dòng),導(dǎo)致冰晶局部凍結(jié)溫度非平衡性下降。當(dāng)表面達(dá)到一個(gè)特征曲率時(shí)冰晶停止生長,此時(shí)冰與水之間的蒸汽壓處于平衡狀態(tài),不發(fā)生額外的結(jié)晶。繼續(xù)降低溫度使特征曲率增加,當(dāng)溫度到達(dá)滯回冰點(diǎn)時(shí),曲率達(dá)到了最大凸度,進(jìn)一步冷卻導(dǎo)致冰晶體的“爆發(fā)”,即以一種看上去爆炸性的方式生長。

3 結(jié)論

本文主要研究了<1 kDa、1～3 kDa、3～5 kDa和>5 kDa等4種不同分子質(zhì)量膠原抗凍肽的熱滯活性、重結(jié)晶抑制能力及修飾單冰晶生長的能力。結(jié)果表明,不同分子質(zhì)量膠原抗凍肽均具有調(diào)節(jié)冰晶生長和熱滯的能力。其中3～5 kDa的膠原抗凍肽熱滯活性最高,表明其可以顯著降低結(jié)冰點(diǎn),能夠在低溫度下保護(hù)樣品的生理功能。<1 kDa和>5 kDa的膠原抗凍肽重結(jié)晶抑制活性最好,表明其可保護(hù)樣品組分不受大冰晶的侵害。4種不同分子質(zhì)量的膠原抗凍肽均具有修飾冰晶生長形態(tài)的效應(yīng),其中3～5 kDa的膠原抗凍肽具有最強(qiáng)地抑制單冰晶生長的能力。綜上可見,膠原抗凍肽的分子質(zhì)量分布對(duì)其冰結(jié)構(gòu)活性至關(guān)重要,因而在實(shí)際應(yīng)用過程中,可以通過調(diào)整酶解參數(shù)控制膠原抗凍肽的分子質(zhì)量,使之滿足于不同的需求。