李潔媛,李東,童凱,雷雨,姜斌,唐璇,李亞蘭

(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院,四川 宜賓,644000)

紅茶是典型的全發(fā)酵茶,茶湯醇厚、色澤紅艷、香氣馥郁,受到消費(fèi)者廣泛喜愛[1]。紅茶中的茶黃素(theaflavins,TFs)是影響紅茶品質(zhì)的關(guān)鍵成分,而且在醫(yī)藥、保健、食品、美容等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景[2]。在紅茶發(fā)酵的過程中,主要通過細(xì)胞的多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)將兒茶素酶促氧化生成TFs[3],但TFs生成量極低且隨季節(jié)變化波動較大,因此較難直接從紅茶中規(guī)模化獲取。大量研究表明,酶促合成法是工業(yè)化生產(chǎn)TFs的一條重要途徑,其既能提高產(chǎn)物產(chǎn)量,又能解決季節(jié)性限制的問題[4]。酶促合成法是指利用外源(植物源和微生物源)PPO將兒茶素類物質(zhì)氧化合成TFs[5]。近年,研究多利用PPO粗酶液酶促合成TFs,但粗酶液純度較低,存在大量雜質(zhì)和干擾成分會影響TFs的生成[6]。

課題組前期試驗發(fā)現(xiàn),多種植物的PPO粗酶液均能酶促合成TFs,但合成能力存在差異。經(jīng)過初步篩選,試驗選擇使用分布廣泛、價格適宜、PPO含量較高、酶促合成能力較強(qiáng)的馬鈴薯作為試驗材料,分離純化得到馬鈴薯PPO純酶,并分析其酶學(xué)性質(zhì)和酶促合成TFs能力,期望為工業(yè)化制備TFs提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑

馬鈴薯,新鮮市售；茶黃素(theaflavin,TF)、茶黃素-3-沒食子酸酯(theaflavin-3-gallate,TF-3-G)、茶黃素-3’-沒食子酸酯(theaflavin-3’-gallate,TF-3’-G)、茶黃素-3,3′-雙沒食子酸酯(theaflavine-3,3′-digallate,TFDG),成都德思特生物技術(shù)有限公司；SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒,Solarbio科技有限公司；DEAE-Sepharose Fast Flow、茶多酚,上海源葉生物科技有限公司,經(jīng)本實驗室檢測其主要成分見表1。

表1 茶多酚的主要成分含量 單位：mg/L

1.2 儀器與設(shè)備

HD-4L電腦核酸蛋白檢測儀,上海滬西分析儀器廠有限公司；垂直板電泳槽、電泳儀,美國Bio-Rad生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司；Agilent 1260高效液相色譜儀、EC-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,2.7 μm),美國Agilent科技有限公司。

2 試驗方法

2.1 PPO的分離純化

2.1.1 粗酶液浸提

參考許雷[7]的方法并稍作修改。將25 g馬鈴薯和50 mL預(yù)冷的磷酸緩沖液勻漿后隔夜浸提12 h,并將浸提液于4 ℃、9 000 r/min條件下離心30 min,收集上清液,即得粗酶液。

2.1.2 硫酸銨沉淀和透析

參照滕杰[8]的方法并稍作修改。向粗酶液中緩慢加入等體積的硫酸銨飽和溶液,攪拌均勻后靜置6 h。將混合液置于4 ℃、9 000 r/min條件下離心30 min,取不同飽和度的硫酸銨沉淀復(fù)溶后再離心10 min。通過比較上清液的比活力,選出硫酸銨沉淀的最適飽和度,取比活力最高的目標(biāo)酶液透析18 h備用。

2.1.3 陰離子交換層析

參照滕杰[8]的方法并稍作修改。將透析后的酶液于DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱上樣,待樣品被離子交換劑吸附后,依次用0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L的NaCl緩沖液進(jìn)行洗脫,每管收集5 mL,流速設(shè)定為0.5 mL/min,每個梯度洗脫6個柱體積,利用核酸蛋白檢測儀觀察280 nm波長處的紫外吸光值,同時收集并比較各蛋白洗脫峰的比活力,最后收集目標(biāo)酶液透析、濃縮、冷凍干燥備用。

2.1.4 SDS-PAGE凝膠電泳

根據(jù)凝膠試劑盒使用說明對目標(biāo)酶液進(jìn)行SDS-PAGE垂直板電泳純度鑒定,濃縮膠和分離膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5%和12%,上樣量為15 μL,樣品在濃縮膠和分離膠中遷移時的電壓分別為100和120 V。經(jīng)考馬斯亮藍(lán)快速染色液染色并搖床脫色后,判斷目標(biāo)酶液是否為單一蛋白條帶，并計算其相對分子質(zhì)量。

2.2 PPO的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.1.2 最適pH分析

將酶液和不同pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)的緩沖液等體積混合組成反應(yīng)體系,30 ℃水浴鍋內(nèi)保溫30 min,測其酶活力,并以最高酶活力為100%，計算其余相對酶活力,由此確定最適pH。

2.2.2 最適溫度分析

在最適pH下,將酶反應(yīng)體系分別放置在20、30、40、50、60、70、80、90 ℃水浴鍋內(nèi)保溫30 min,測其酶活力,并以最高酶活力為100%計算其余相對酶活力,由此確定最適溫度。

2.2.3 金屬離子對酶活性影響

在最適pH和溫度下,向已除去內(nèi)源金屬離子的酶液中等體積加入含有以下種類、濃度金屬離子的緩沖液,即0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08 mol/L的Na+(NaCl)、K+(KCl)、Ca2+(CaCl2)、Al3+(AlCl3)、Mg2+(MgCl2)、Zn2+(ZnCl2)、Mn2+(MnCl2)、Cu2+(CuCl2)、Fe2+(FeCl2)、Fe3+(FeCl3)。分別測定其酶活力,以未添加金屬離子的酶活力為100%，計算其余相對酶活力,由此比較各金屬離子對PPO酶活性影響。

2.3 PPO酶促合成TFs

參照黃瑩捷等[4]的方法并稍作修改。將90 μL PPO粗酶液、純酶液分別與840 μL 5 mg/mL的兒茶素反應(yīng)液組成反應(yīng)體系,置于30 ℃的搖床內(nèi)劇烈反應(yīng)1.5 h。待酶促合成結(jié)束后,立即用微波高火終止反應(yīng),離心收集上清液并過0.45 μm微孔濾膜備用。

2.4 PPO比活力測定

參考李遠(yuǎn)華[9]的方法并稍作修改。將1.5 mL磷酸緩沖液和0.5 mL酶液混合均勻,30 ℃水浴保溫5 min,加入1.0 mL鄰苯二酚迅速反應(yīng),記錄每分鐘420 nm波長處吸光值的變化情況。酶活力定義：每分鐘吸光值變化0.001為1個酶活單位(U)。

利用考馬斯亮藍(lán)染色法[10]測定PPO酶液的蛋白質(zhì)含量。

1 min內(nèi),1 mg蛋白質(zhì)吸光值變化0.001定義為1個比活力單位,其常用酶活力和蛋白質(zhì)含量的比值表示[11]。

2.5 TFs含量的測定

參考潘海波[12]的超高效液相色譜法并稍作修改。色譜條件：流動相A為0.1%的甲酸溶液，流動相B為乙腈,流速0.4 mL/min,柱溫35 ℃,檢測波長280 nm,進(jìn)樣量15 μL。梯度洗脫程序：0～30 min,流動相A 90%→60%,流動相B 10%→40%；30～40 min,流動相A 60%→90%,流動相B 40%→10%。

2.6 TFs的轉(zhuǎn)化率

PPO酶促合成TFs的能力可以用TFs的轉(zhuǎn)化率[4]表示,根據(jù)公式(1)計算TFs的轉(zhuǎn)化率：

(1)

3 結(jié)果與討論

3.1 PPO分離純化結(jié)果分析

3.1.1 硫酸銨沉淀結(jié)果分析

根據(jù)蛋白質(zhì)分子顆粒大小和親水程度的不同,通過增大硫酸銨鹽溶液濃度,可使高濃度的鹽離子與蛋白質(zhì)競爭水分子,從而破壞蛋白質(zhì)表面的水化膜,降低其溶解度,最終使得目標(biāo)蛋白析出[13]。當(dāng)加入飽和度為20%的硫酸銨溶液時,蛋白質(zhì)和酶活力均較低,開始有少量目標(biāo)蛋白析出。當(dāng)硫酸銨溶液飽和度增大至60%時,蛋白質(zhì)和酶活力也隨之增大,有部分目標(biāo)蛋白和大量雜蛋白析出。當(dāng)加入飽和度70%～90%的硫酸銨溶液時,蛋白質(zhì)含量減小,酶活力增至最高,開始有大量目標(biāo)蛋白析出。故本試驗采用最適宜的80%飽和度硫酸銨溶液回收酶活力高、雜蛋白少的目標(biāo)蛋白,具體結(jié)果見圖1。

圖1 飽和硫酸銨沉淀目標(biāo)蛋白Fig.1 Target protein precipitated by saturated ammonium sulfate solution

3.1.2 陰離子交換層析結(jié)果分析

利用不同濃度的NaCl緩沖液對透析后的目標(biāo)酶液進(jìn)行梯度洗脫,一共得到5個洗脫峰,根據(jù)洗脫管的先后依次編號Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ。其中,Ⅰ號峰具有較高的酶活力、蛋白質(zhì)含量和吸光度值,其可能是未被吸附的穿透峰[14]。Ⅱ號峰的酶活力和蛋白質(zhì)含量偏低,可能是洗脫液濃度偏低,未能洗脫出大量目標(biāo)蛋白。Ⅲ、Ⅳ號峰的酶活力>20 U,故能洗脫出少量目標(biāo)蛋白。而Ⅴ號洗脫峰具有最高比活力和酶活力,可能含有大量目標(biāo)蛋白,具體結(jié)果見圖2。

a-陰離子交換層析洗脫曲線;b-各洗脫峰的比活力、酶活力、蛋白質(zhì)含量圖2 陰離子交換層析結(jié)果Fig.2 Results of anion exchange chromatography

馬鈴薯PPO經(jīng)過分離純化處理后,其比活力不斷增大,蛋白質(zhì)含量和酶活力不斷下降,說明在純化過程中目標(biāo)蛋白得以濃縮純化但酶活力存在自然損耗。最終,PPO純酶的比活力為21.79 U/mg、回收率為17.15%、純化倍數(shù)為14.43,具體結(jié)果見表2。

表2 分離純化的結(jié)果Table 2 Result of separation and purification

3.1.3 目標(biāo)蛋白電泳純度鑒定

收集Ⅴ號峰的目標(biāo)蛋白進(jìn)行電泳純度鑒定。結(jié)果顯示(圖3),目標(biāo)蛋白呈現(xiàn)單一電泳條帶,表明本實驗獲得的目標(biāo)蛋白達(dá)到電泳純度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白的相對遷移率，測得其分子質(zhì)量約為42 kDa。賀立紅等[15]研究指出,不同植物PPO的分子質(zhì)量存在差異,但其大多分子質(zhì)量為40 k～70 kDa,與本實驗研究結(jié)果基本一致。

圖3 PPO的SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE of PPO

3.2 PPO酶學(xué)性質(zhì)分析

3.2.1 最適pH分析

PPO最適pH為6.0,在弱酸性條件下(pH 6.0～7.0),PPO能保持90%以上的相對酶活力；在酸性或堿性條件下(pH<4.0或pH>10.0),PPO相對酶活力將降至30%以下,具體結(jié)果見圖4。研究結(jié)果與李俊等[16]研究結(jié)果一致,馬鈴薯PPO在弱酸性條件下穩(wěn)定性較好,但在酸性、堿性環(huán)境中酶活力較低,這是因為反應(yīng)體系的酸堿度將影響酶蛋白的活性中心,并改變其解離狀態(tài)。

圖4 PPO的最適pHFig.4 Optimum pH of PPO

3.2.2 最適溫度分析

張帥等[17]研究表明,溫度對PPO酶活力有較大影響,具體可分為2個階段：前一階段,隨溫度升高,酶促反應(yīng)速率升高;后一階段,溫度進(jìn)一步升高,酶發(fā)生不可逆熱變性,酶促反應(yīng)速率下降。本研究中觀察到類似現(xiàn)象,反應(yīng)體系從低溫升至30 ℃時,PPO酶活力隨之升高;溫度繼續(xù)升高時,其酶活力不斷下降,溫度升至90 ℃時,相對酶活力僅剩20%。因此本實驗中,PPO最適溫度為30 ℃(圖5)。

圖5 PPO的最適溫度Fig.5 Optimum temperature of PPO

3.2.3 金屬離子對酶活性影響的分析

如圖6所示,Al3+、Mg2+和Zn2+對PPO酶活力有激活作用。在0.01 mol/L的低濃度下,Zn2+可使PPO相對酶活力提高至130%；Al3+和Mg2+的濃度分別升至0.08和0.04 mol/L時,才能將相對酶活力提高至120%。Na+、K+和Ca2+對酶活力沒有顯著影響,而Cu2+和Mn2+對酶活力有著輕微抑制作用。

圖6 金屬離子對PPO活力的影響Fig.6 Effect of metal ion on PPO activity

在試驗過程中,向反應(yīng)體系中添加Fe2+和Fe3+分別出現(xiàn)淡藍(lán)色和墨綠色的絮狀物,無法測定其酶活力,推測其原因可能是pH>4時,鐵鹽和酚類反應(yīng)生成有色物質(zhì)。試驗結(jié)果和黃浩[18]所得結(jié)果基本一致,故利用PPO酶促合成TFs時可適量添加金屬離子Al3+、Mg2+和Zn2+,以輔助提高PPO酶活力。

3.3 PPO酶促合成TFs

利用酶活力相近的PPO粗酶和純酶(酶活力分別為34.5和37.4 U、比活力分別為1.51和21.79 U/mg)分別酶促合成TFs,TFs的生成量分別是(0.096 1±0.000 5)和(0.237 8±0.013 2)g/L,TFs的轉(zhuǎn)化率分別為(9.24±0.05)%和(22.86±1.27)%。同時,馬鈴薯PPO酶促合成TFs單體存在偏好性,TFDG和TF是最主要的TFs合成單體(圖7)。

圖7 酶對茶黃素類物質(zhì)生成量的影響Fig.7 Effects of enzymes on theaflavins production注：TFs含量為TF、TF-3-G、TF-3’-G、TFDG的總和

由此可以看出,當(dāng)酶活力相近時,其酶促合成TFs的能力與其比活力呈正相關(guān)。試驗結(jié)果與陳盛虎[19]和許雷等[20]所得結(jié)果一致,比活力高、純化效果好的PPO酶促合成TFs的效果更好。羅玲[21]和王佛生等[6]也曾利用馬鈴薯PPO粗酶液酶促合成TFs,分別得到以TF和TF-3-G為主的TFs合成單體,與本試驗結(jié)果存在差異。其原因可能是各試驗所選擇的底物兒茶素含量存在差異,正如DAVIES等[22]提出的,各類兒茶素單體通過復(fù)雜多樣的苯駢環(huán)化作用形成不同的茶黃素類物質(zhì)。

4 結(jié)論

本研究以馬鈴薯為供試材料,通過磷酸緩沖液浸提、 80%硫酸銨沉淀、透析和陰離子交換層析分離純化得到電泳純的馬鈴薯PPO,其比活力為21.79 U/mg,回收率為17.15%,純化倍數(shù)為14.43倍,分子質(zhì)量約為42 kDa。其相關(guān)的酶學(xué)性質(zhì)如下：最適pH 6.0,最適溫度30 ℃,在20～30 ℃和pH 5.0～6.0時,能夠保持較好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性。同時,金屬離子Na+、K+和Ca2+對酶活力無較大影響,Al3+、Mg2+和Zn2+對酶活力有激活作用,Cu2+和Mn2+對酶活力存在抑制作用。馬鈴薯PPO粗酶和純酶均可酶促合成TFs,其最大生成量分別為(0.096 1±0.000 5)和(0.237 8±0.013 2) g/L,TFs轉(zhuǎn)化率分別為(9.24±0.05)%和(22.86±1.27)%。在酶活力相近時,純化后的、比活力高的PPO酶促合成TFs的效果更好。故在利用馬鈴薯PPO工業(yè)化制備TFs時,可參考采用比活力較高的PPO,并將其置于pH 6.0、30 ℃、適當(dāng)添加Al3+、Mg2+和Zn2+等金屬離子的反應(yīng)體系中,以獲得更多的目標(biāo)產(chǎn)物TFs。