季旭,趙帥東,周滟晴,張佳卉,劉婷,汪立平,2,3*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院,上海,201306) 2(農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏與保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海),上海,201306) 3(上海海洋大學(xué) 食品熱加工工程技術(shù)研究中心,上海,201306)

透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡糖的雙糖單位聚合而成的酸性黏多糖,通過(guò)β-1,3和β-1,4糖苷鍵連接[1]。由于其獨(dú)特的流變學(xué)特性、生物相容性及非免疫原性,被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品和保健食品等領(lǐng)域[2-3]。隨著需求量的日益增大,HA的市場(chǎng)價(jià)值預(yù)計(jì)在2025年會(huì)達(dá)到154億美元[4]。目前,HA主要有2種生產(chǎn)方法,即動(dòng)物組織提取法和微生物發(fā)酵法。微生物發(fā)酵生產(chǎn)較傳統(tǒng)提取法有不受動(dòng)物原料資源限制、易于大規(guī)模生產(chǎn)、無(wú)動(dòng)物源致病病毒感染的危險(xiǎn)和分離純化成本低等優(yōu)點(diǎn)[5-6],已成為工業(yè)化生產(chǎn)HA的主要方式。在工業(yè)上,HA的常用生產(chǎn)菌株為獸疫鏈球菌和馬鏈球菌[7],產(chǎn)量可達(dá)到6～7 g/L[8],但同時(shí)產(chǎn)生透明質(zhì)酸酶和鏈球菌溶血素,其中透明質(zhì)酸酶會(huì)降低HA的產(chǎn)量[9],鏈球菌溶血素可引起溶血[10]。近年來(lái),以安全的(generauy recognized as safe,GRAS)微生物菌株為生產(chǎn)菌株發(fā)酵生產(chǎn)HA,成為一種比較理想的替代選擇[11]。如枯草芽孢桿菌[12]、乳酸菌[13]、大腸桿菌[14]和谷氨酸棒桿菌[15]等,但是重組菌株的HA生產(chǎn)成本相對(duì)較高[4]。IZAWA等[16-17]通過(guò)GRAS菌株嗜熱鏈球菌發(fā)酵生產(chǎn)HA,優(yōu)化發(fā)酵條件后的HA產(chǎn)量為208 mg/L。由于此類GRAS菌株的HA產(chǎn)量較低,這極大地限制了工業(yè)應(yīng)用。因此,通過(guò)菌株的誘變選育和發(fā)酵工藝的優(yōu)化來(lái)提高GRAS菌株的HA產(chǎn)量勢(shì)在必行。

本研究以實(shí)驗(yàn)室保藏GRAS透明質(zhì)酸產(chǎn)生菌株BacillusvelezensisZ1為出發(fā)菌株,通過(guò)紫外誘變,篩選出高產(chǎn)HA且穩(wěn)定性良好的突變株,對(duì)其搖瓶發(fā)酵的培養(yǎng)基成分與發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,以期進(jìn)一步提高其HA產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)Z1,本實(shí)驗(yàn)室保藏,從豬鼻黏膜中分離得到。

1.1.2 培養(yǎng)基

血瓊脂平板培養(yǎng)基(g/L)：牛肉浸膏10.0,胰蛋白胨5.0,NaCl 5.0,瓊脂15.0,pH值為7.0,在121 ℃下滅菌20 min,待冷卻至50 ℃,在無(wú)菌條件下加入5%無(wú)菌脫纖維羊血。

透明質(zhì)酸培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨15.0,酵母粉5.0,K2HPO4·3H2O 2.0,MgSO4·7H2O 0.5,HA 1.0,瓊脂20.0,pH值為7.0,在121 ℃下滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖12.5,酵母浸膏12.5,胰蛋白胨12.5,MgSO4·7H2O 0.5,KH2PO42.0,pH值為7.0,在121 ℃下滅菌20 min。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖40.0,牛肉浸膏10.0,胰蛋白胨10.0,MgSO4·7H2O 1.0,KH2PO42.0,pH值為7.0,在121 ℃下滅菌20 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：挑取2～3環(huán)初始菌株,接入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,150 r/min,37 ℃振蕩培養(yǎng)。

搖瓶發(fā)酵：按體積分?jǐn)?shù)10%的接種量將種子液接入裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中,150 r/min,37 ℃振蕩培養(yǎng)。

1.2.2 紫外誘變實(shí)驗(yàn)

(1)菌懸液的制備:將菌株Z1接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h,菌液經(jīng)4 200 r/min離心10 min,棄上清液,用無(wú)菌生理鹽水洗滌2次,再重懸于無(wú)菌生理鹽水中,調(diào)整菌懸液濃度至107CFU/mL,并放在無(wú)菌環(huán)境中保存?zhèn)溆肹18]。

(2)紫外誘變與突變株的篩選:紫外燈功率為30 W,照射距離為30 cm,需提前預(yù)熱20 min。將5 mL的菌懸液和無(wú)菌回形針?lè)湃胫睆綖? cm的無(wú)菌培養(yǎng)皿中,并置于磁力攪拌器上攪拌。照射時(shí)間分別為0、20、40、50、60、70、80、100 s。誘變結(jié)束后,倒入新的種子培養(yǎng)基,在暗室內(nèi)37 ℃靜置培養(yǎng)12 h,以避免光復(fù)活對(duì)誘變的影響[19]。將所得菌液梯度稀釋至10-4～10-6倍,各取100 μL涂布于血瓊脂平板上,在避光條件下,37 ℃培養(yǎng)24 h。按公式(1)計(jì)算致死率[20]:

(1)

在血瓊脂平板上挑取菌落直徑與黏度較大的菌株,再劃線于透明質(zhì)酸平板上,選取不產(chǎn)生透明圈的單菌落,種子培養(yǎng)14 h,搖瓶發(fā)酵16 h,測(cè)定HA產(chǎn)量,篩選出產(chǎn)量較高菌株。

(3)突變株的傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):將篩選到的突變株作為第1代接種到血瓊脂平板上,傳代至第4代,并測(cè)定搖瓶發(fā)酵后的HA產(chǎn)量,進(jìn)一步篩選出產(chǎn)量較高且穩(wěn)定的突變株。

1.2.3 發(fā)酵工藝的優(yōu)化

1.2.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

將HA產(chǎn)量較高且穩(wěn)定的突變株接入種子培養(yǎng)基,種子培養(yǎng)14 h,再搖瓶發(fā)酵24 h,測(cè)定HA產(chǎn)量。

單因素試驗(yàn)：

(1)碳源：以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),改變其中的葡萄糖質(zhì)量濃度(20、40、60、80、100 g/L),測(cè)定HA產(chǎn)量。

(2)氮源：以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),選擇胰蛋白胨和牛肉浸膏進(jìn)行復(fù)配[21],測(cè)定HA產(chǎn)量。

(3)無(wú)機(jī)鹽：以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),分別考察MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L)和KH2PO4質(zhì)量濃度(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/L)對(duì)HA產(chǎn)量的影響。

響應(yīng)面優(yōu)化：

在發(fā)酵培養(yǎng)基成分單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理,選取葡萄糖質(zhì)量濃度、胰蛋白胨質(zhì)量濃度、牛肉浸膏質(zhì)量濃度和MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度4個(gè)因素,HA產(chǎn)量為響應(yīng)值,進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

1.2.3.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

單因素試驗(yàn)：

(1)裝液量：在培養(yǎng)基成分優(yōu)化的基礎(chǔ)上,以不同的裝液量(60、80、100、120、140 mL)裝入錐形瓶中,測(cè)定HA產(chǎn)量。

(2)初始pH值：在培養(yǎng)基成分優(yōu)化的基礎(chǔ)上,改變發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值(6.2、6.6、7.0、7.4、7.8),測(cè)定HA產(chǎn)量。

(3)溫度：在培養(yǎng)基成分優(yōu)化的基礎(chǔ)上,調(diào)整發(fā)酵溫度(31、33、35、37、39 ℃),測(cè)定HA產(chǎn)量。

(4)搖床轉(zhuǎn)速：在培養(yǎng)基成分優(yōu)化的基礎(chǔ)上,調(diào)整搖床轉(zhuǎn)速(50、100、150、200 r/min),測(cè)定HA產(chǎn)量。

正交優(yōu)化：

根據(jù)發(fā)酵條件單因素試驗(yàn)結(jié)果,確定裝液量、初始pH值、溫度和搖床轉(zhuǎn)速的因素水平,進(jìn)行4因素3水平的正交優(yōu)化試驗(yàn)。

1.2.4 HA產(chǎn)量的測(cè)定

參照Bitter-Muir法[22]。取5 mL發(fā)酵液,4 200 r/min離心15 min,上清液加入2倍體積的無(wú)水乙醇,4 ℃靜置1 h,再次離心取沉淀,加入一定體積的去離子水,振蕩溶解,然后進(jìn)行HA產(chǎn)量的測(cè)定。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)均有3個(gè)平行。采用軟件Design-Expert V 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面的數(shù)據(jù)分析與處理。采用軟件SPSS Statistics 21.0進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理。采用Origin Pro 9.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外誘變

2.1.1 紫外誘變時(shí)間的確定

由圖1可知,隨著紫外照射時(shí)間的增加,菌株致死率也在不斷提高。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,致死率一般應(yīng)控制在80%～90%為宜[23]。當(dāng)照射時(shí)間為60 s時(shí),菌株致死率為82.88%,70～100 s時(shí),致死率均在90%以上。因此,確定紫外照射時(shí)間60 s為菌株Z1的最佳誘變時(shí)間。

圖1 紫外誘變時(shí)間對(duì)B.velezensis Z1致死率的影響Fig.1 Effect of UV mutation time on the mortality of B.velezensis Z1

2.1.2 高產(chǎn)HA突變株的篩選

菌株Z1的菌懸液經(jīng)過(guò)紫外照射60 s后,涂布于血瓊脂平板37 ℃培養(yǎng)24 h。在血瓊脂平板上挑取菌落直徑較大、黏度較大的單菌落[5,24],搖瓶發(fā)酵后測(cè)定其HA產(chǎn)量,各突變株的HA產(chǎn)量如表1所示。其中,突變株ZV2、ZV7、ZV13的HA產(chǎn)量提高了5%～10%,突變株ZV1、ZV3、ZV11、ZV12的HA產(chǎn)量提高了10%～25%,正突變率達(dá)到41.18%。

表1 突變株的HA產(chǎn)量Table 1 The HA yield of the mutant strains

由前期實(shí)驗(yàn)可知,出發(fā)菌株Z1在透明質(zhì)酸平板上有輕微的透明圈產(chǎn)生,紫外誘變后,將上述4株突變株分別在透明質(zhì)酸平板上劃線,菌落周圍無(wú)透明圈產(chǎn)生,表明這些突變株均為透明質(zhì)酸酶陰性菌株,不產(chǎn)透明質(zhì)酸酶,這有利于維持HA產(chǎn)量的穩(wěn)定。

2.1.3 高產(chǎn)HA突變株的遺傳穩(wěn)定性

對(duì)HA產(chǎn)量提升較大的突變株(ZV1、ZV3、ZV11、ZV12)進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn),共傳代4次,經(jīng)過(guò)搖瓶發(fā)酵測(cè)定HA產(chǎn)量,結(jié)果如圖2所示。其中,突變株ZV1的HA產(chǎn)量在每一代中相比于其他突變株較高,其產(chǎn)HA能力無(wú)顯著性差異(P>0.05),說(shuō)明該菌株具有穩(wěn)定的遺傳性。因此,選取突變株ZV1進(jìn)行發(fā)酵工藝的優(yōu)化。

圖2 突變株的傳代穩(wěn)定性Fig.2 The genetic stability of the mutant strains

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn)

對(duì)于碳源而言,以葡萄糖為單一碳源時(shí),突變株ZV1發(fā)酵生產(chǎn)HA的效果較好,與之前的研究相似[25]。以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),不同葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)HA產(chǎn)量的影響如圖3-a所示。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度增加到60 g/L時(shí),HA產(chǎn)量最高,確定葡萄糖質(zhì)量濃度優(yōu)選為60 g/L。

a-葡萄糖；b-胰蛋白胨；c-牛肉浸膏；d-MgSO4·7H2O；e-KH2PO4圖3 培養(yǎng)基成分對(duì)B.velezensis ZV1 HA產(chǎn)量的影響Fig.3 The effect of medium components on HA yield of B.velezensis ZV1

對(duì)于氮源而言,經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),選擇多種氮源進(jìn)行復(fù)配,更有利于HA產(chǎn)生菌株的發(fā)酵生產(chǎn)[21]。復(fù)配方式：牛肉浸膏質(zhì)量濃度10 g/L,與不同質(zhì)量濃度的胰蛋白胨進(jìn)行復(fù)配添加；胰蛋白胨質(zhì)量濃度10 g/L,與不同濃度的牛肉浸膏進(jìn)行復(fù)配添加,復(fù)配氮源對(duì)HA產(chǎn)量的影響如圖3-b和圖3-c所示。在胰蛋白胨質(zhì)量濃度達(dá)到10 g/L之后,HA產(chǎn)量開始降低,確定胰蛋白胨質(zhì)量濃度優(yōu)選為10 g/L；在牛肉浸膏質(zhì)量濃度達(dá)到15 g/L之前,HA產(chǎn)量在不斷增加,隨后HA產(chǎn)量開始下降,確定牛肉浸膏質(zhì)量濃度優(yōu)選為15 g/L。

對(duì)于無(wú)機(jī)鹽而言,在合成HA的過(guò)程中,適當(dāng)質(zhì)量濃度的Mg2+可保證菌體的生長(zhǎng)和HA的生產(chǎn),K+可用于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[19]。分別考察MgSO4·7H2O和KH2PO4質(zhì)量濃度對(duì)HA產(chǎn)量的影響,結(jié)果如圖3-d和圖3-e所示。不同質(zhì)量濃度的MgSO4·7H2O對(duì)HA產(chǎn)量有顯著性差異(P<0.05),

MgSO4·7H2O的質(zhì)量濃度為1.5 g/L時(shí),HA產(chǎn)量達(dá)到最大值,為0.55 g/L；不同KH2PO4質(zhì)量濃度下,HA產(chǎn)量在0.35～0.44 g/L之間,說(shuō)明KH2PO4質(zhì)量濃度對(duì)于HA產(chǎn)量的影響可忽略,與CHEN等[10]的研究相似。

2.2.2 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取葡萄糖質(zhì)量濃度、胰蛋白胨質(zhì)量濃度、牛肉浸膏質(zhì)量濃度和MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度作為4個(gè)因素。利用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理,對(duì)4因素3水平進(jìn)行響應(yīng)面分析,試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental design and results of Box-Behnken

續(xù)表2

由表3可知,該模型的P<0.000 1,極顯著,失擬項(xiàng)的P值為0.064 5(P>0.05),差異不顯著,說(shuō)明該模型回歸顯著,失擬不顯著；擬合優(yōu)度判定系數(shù)(R2)為0.901 1,說(shuō)明該模型擬合程度較好,可用于發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化時(shí)HA產(chǎn)量的預(yù)測(cè)。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

其中,交互項(xiàng)(X1X2,X1X3,X1X4,X2X3,X2X4,X3X4)的P值均大于0.05,表明任意2種因素對(duì)響應(yīng)值的交互作用影響不顯著。響應(yīng)面圖可反映交互作用的影響程度,等高線的形狀趨近于圓形表明交互作用不顯著,趨近于橢圓形則表明顯著[26]。如圖4所示,交互項(xiàng)等高線的形狀趨近于圓形,表明各因素間的交互作用不顯著,與方差分析結(jié)果相一致。

圖4 各因素交互作用對(duì)B.velezensis ZV1 HA產(chǎn)量影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface for the alternative effects of various factors on HA yield of B.velezensis ZV1

通過(guò)Design-Expert軟件分析得到最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(g/L)：葡萄糖69.5,胰蛋白胨10.2,牛肉浸膏14.8,MgSO4·7H2O 1.5,HA產(chǎn)量的最大預(yù)測(cè)值為 0.671。為了驗(yàn)證響應(yīng)面分析的準(zhǔn)確性,進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),測(cè)得HA產(chǎn)量的平均值為0.690 g/L,與模型預(yù)測(cè)值有較高的一致性。

2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

對(duì)發(fā)酵條件中的溫度、pH值、裝液量和搖床轉(zhuǎn)速進(jìn)行單因素試驗(yàn),結(jié)果如圖5所示。

a-溫度；b-pH值；c-裝液量；d-搖床轉(zhuǎn)速圖5 發(fā)酵條件對(duì)B.velezensis ZV1 HA產(chǎn)量的影響Fig.5 The influence of fermentation conditions on HA yield of B.velezensis ZV1

在發(fā)酵條件的單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)L9(34),結(jié)果如表4所示。因此,最佳發(fā)酵條件為：pH值 7.0,搖床轉(zhuǎn)速150 r/min,溫度35 ℃,裝液量140 mL。按照上述發(fā)酵條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn),HA產(chǎn)量平均值達(dá)到0.972 g/L,與正交試驗(yàn)分析結(jié)果基本一致。

表4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and results of orthogonal experiment

2.4 最優(yōu)發(fā)酵工藝條件下突變株ZV1的測(cè)定

經(jīng)紫外誘變所得的突變株ZV1,在最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基成分與最佳發(fā)酵條件的發(fā)酵工藝下,發(fā)酵16 h,突變株ZV1的HA產(chǎn)量達(dá)到最大值,為1.169 g/L,相較于出發(fā)菌株Z1(0.774 g/L)提高了51.03%,比IZAWA等[17]優(yōu)化后的GRAS菌株HA產(chǎn)量(208 mg/L)要高,更具有工業(yè)化的應(yīng)用潛力。

3 結(jié)論

本研究以GRAS透明質(zhì)酸產(chǎn)生菌株BacillusvelezensisZ1為出發(fā)菌株,經(jīng)過(guò)紫外誘變后,得到1株高產(chǎn)HA且穩(wěn)定性良好、透明質(zhì)酸酶陰性的突變株ZV1。利用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法分析,得到最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基成分：葡萄糖69.5 g/L,胰蛋白胨10.2 g/L,牛肉浸膏14.8 g/L,MgSO4·7H2O 1.5 g/L；再通過(guò)正交試驗(yàn)得到最佳發(fā)酵條件：pH值7.0,搖床轉(zhuǎn)速150 r/min,溫度35 ℃,裝液量140 mL。在此最優(yōu)發(fā)酵工藝條件下,突變株ZV1的HA產(chǎn)量最大可達(dá)到1.169 g/L,比出發(fā)菌株Z1提高了51.03%。因此,菌株的誘變選育與發(fā)酵工藝的優(yōu)化可有效提高HA產(chǎn)量,這對(duì)于此類GRAS透明質(zhì)酸產(chǎn)生菌株在HA工業(yè)化的發(fā)酵生產(chǎn)有一定的應(yīng)用價(jià)值。