王效軍，黃 潔，梁慧琳，徐秀娟（廣東醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東東莞 523808）

登革病毒（DENV）有4 個血清型（DENV1?4）[1]，肝細胞對各型DENV普遍易感，不同血清型間具有一定的交叉免疫反應(yīng)，可發(fā)生抗體依賴的感染增強效應(yīng)（ADE）[2]。NS1 是DENV 中主要的非結(jié)構(gòu)蛋白，NS1抗體與細胞表面的相應(yīng)抗原相互作用并引起信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進細胞激活增加病毒產(chǎn)量和釋放，有助于DENV 的ADE 發(fā)病機制的形成[3]。長鏈非編碼RNA（lncRNA）作為新的調(diào)控分子具有表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等功能在病毒感染中發(fā)揮重要生物學(xué)調(diào)控功能[4?5]，DENV 感染致肝細胞損傷中l(wèi)ncRNA 的表達及可能的生物學(xué)作用尚不明確。本研究模擬建立體外DENV 感染L?02 細胞的ADE 模型，探討DENV感染致ADE 中l(wèi)ncRNA 差異表達及可能的生物學(xué)作用，為登革熱的預(yù)防控制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 登革病毒液滴度測定

調(diào)整C6/36 細胞濃度為1×106個/mL，每孔加入100 μL懸液制備96孔板，DENV2病毒液（南方醫(yī)科大學(xué)病原生物系惠贈）用RPMI?1640維持液（2%FBS）連續(xù)10 倍稀釋（10?1～10?8），用Reed?Muench 方法[6]計算病毒液的滴度（TCID50）。

1.2 L?02 細胞ADE 模擬感染條件的篩選及樣品制備

（1）RPMI?1640 培養(yǎng)基（10%FBS，1%青鏈霉素混合液）37 ℃（5%CO2）培養(yǎng)L?02細胞，調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL，每孔加入1 mL懸液制備6孔板。

（2）鼠源抗DENV1 NS1 抗體用RPMI?1640 維持液（2%FBS）進行1:160 稀釋，并與DENV2 病毒液（Moi=0.1、0.5、1.0）37 ℃孵育90 min，然后感染6 孔板中L?02 細胞模擬ADE 效應(yīng)；以RPMI?1640 維持培養(yǎng)基（2%FBS）作為對照組，每組準備4份。

（3）染毒37 ℃（5%CO2）培養(yǎng)48 h 后，吸取上清，定量ELISA 試劑盒測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）吸光度值（OD），利用標準品建立回歸方程，用回歸方程計算每個感染滴度的數(shù)值。感染滴度計算AST/ALT 并依據(jù)如下標準判定[7]：AST/ALT<1.0為輕度損傷，AST/ALT≈1.0 為中度損傷，AST/ALT>1為重度損傷，AST/ALT>2為嚴重損傷。

（4）每個6 孔板吸凈培養(yǎng)上清后的細胞立即加入1 mL TRIzol 試劑，反復(fù)吹吸，吸到另一個2 mL EP 管中，ADE 和對照組每個感染滴度的細胞樣品各4 份，選擇AST/ALT比值最高的感染滴度，其中3份干冰送檢，另一份－80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RNA?Req及差異表達判定

（1）由華大基因公司進行RNA 的提取、合成cD?NA 第二鏈經(jīng)過試劑盒純化并建立測序文庫，并用Il?lumina HiSeqTM2 000進行測序。

（2）以FPKM 值作為衡量轉(zhuǎn)錄本或基因表達水平的指標，ADE 感染組與對照組比較，計算log2ratio(ratio=ADE/對 照)，取log2(ratio)≥1.5 為高表達，log2(ratio)<1.5為低表達[8]。

1.4 差異表達lncRNA 潛在靶基因的功能注釋和預(yù)測

使用TopHat2軟件[9]將對比組差異表達的ln?cRNA 映射到不同的參考基因組，如果lncRNA 映射的位置在某個基因上游的啟動子區(qū)域，則lncRNA 可能在轉(zhuǎn)錄或者轉(zhuǎn)錄后水平對基因的表達進行調(diào)控[10]；如果lncRNA映射的位置在某個基因下游，則lncRNA可能參與其他調(diào)控作用[11]；采用RNAplex軟件[12]，依據(jù)最小自由能預(yù)測lncRNA 與正義鏈mRNA 最佳堿基配對結(jié)合而調(diào)控基因沉默、轉(zhuǎn)錄及mRNA 的穩(wěn)定性，通過PubMed數(shù)據(jù)庫搜索其功能。

1.5 差異表達lncRNA的miRNA前體預(yù)測

研究發(fā)現(xiàn)一部分lncRNA 可做為miRNA 前體，通過酶的剪切后形成miRNA 行使相應(yīng)的功能，特別是成熟的miRNA 可以作用于多個位點，抑制翻譯過程或?qū)е禄虺聊＠胢iRPara軟件[13]或直接將ln?cRNA比對到miRBase數(shù)據(jù)庫，對潛在的miRNA前體及其靶基因探討。

1.6 RT?qPCR驗證

用TRIzol 試劑提取保存樣品的總RNA，試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，合成lncRNA 引物，在ABI7500 定量PCR 儀中應(yīng)用SYBR Green 法對差異表達的lncRNA進行實時定量PCR[14]。擴增后的結(jié)果用ΔCt（循環(huán)臨界值的差值）來評估每個組lncRNA的表達水平，計算方法為ΔCt=（lncRNA 的平均Ct）?（β?actin 的平均Ct），將ΔCt轉(zhuǎn)換為2?ΔCt表示lncRNA的相對表達量[15]。取均值計算，采用兩樣本t檢驗比較lncRNA 在ADE組與對照組的相對表達量差異，并繪制柱狀圖。

1.7 主要數(shù)據(jù)庫

(1) DAVID 在線基因功能注釋數(shù)據(jù)庫，http://da?vid.abcc.ncifcrf.gov/；(2)Gene Ontology 數(shù)據(jù)庫，http://geneontology.org/page/go?database；(3)KEGG 數(shù)據(jù)庫，http://www.kegg.jp/；(4) miRBase 數(shù)據(jù)庫，http://www.cuilab.cn/hmdd。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS25.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同感染滴度L?02 細胞病變及培養(yǎng)上清AST、ALT、AST/ALT比值

培養(yǎng)48 h 后在倒置顯微鏡下觀察L?02 細胞病變，如圖1 可見，其中Moi=0.1 組細胞出現(xiàn)一定皺縮，折光度有增強；Moi=0.5 組細胞有一些脫落；Moi=1.0組細胞脫落明顯，皺縮和折光度增強；對照組細胞未出現(xiàn)明顯病變。

圖1 ADE感染L?02細胞狀態(tài)（48 h，200倍）

根據(jù)回歸方程計算得到每個感染滴度下的AST和ALT值，然后計算AST/ALT比值，如表1所示，L?02細胞在DENV2 感染48 h 后，感染滴度MOI 為0.5 時，AST/ALT 比值最高為2.74，因此，以MOI 為0.5，感染48 h為感染的最適條件，后續(xù)送檢樣品及RT?qPCR驗證均以此為依據(jù)。

表1 ADE模擬致肝細胞損傷中轉(zhuǎn)氨酶檢測結(jié)果

2.2 LncRNA差異表達譜

本研究根據(jù)log2(ratio)≥1.5 為高表達，log2(ra?tio)<1.5為低表達的篩選標準，ADE 組中得到75 個差異表達的lncRNA，其中36 個高表達，39 個低表達。而這75 個差異表達的lncRNA 又可分為46 個已知lncRNA和29個未知lncRNA。

2.3 差異表達lncRNA潛在靶基因的注釋和預(yù)測

對差異表達lncRNA（前10）可能位于某潛在的靶基因上、下游預(yù)測結(jié)果如表2 所示：ADE 中有2 個lncRNA（XLOC023862，XLOC039796）位于某基因上游，2 個lncRNA（n344659，XLOC017926）位于某基因下游。通過堿基互補配對及最小自由能預(yù)測差異表達未知lncRNA（前10）與mRNA 是否存在互作關(guān)系，結(jié)果如表3所示：2個lncRNA（XLOC008997，XLOC029149）與mRNA（NM_002864，NM_032487）存在相互作用。對差異表達lncRNA調(diào)控的基因通過PubMed 數(shù)據(jù)庫搜索該基因的功能，檢索到n344659潛在靶標為基因10236，其編碼蛋白具有miRNA前提處理功能。

表2 差異表達lncRNA(前10)與潛在靶基因上下游關(guān)系預(yù)測

表3 差異表達lncRNA(前10)與靶mRNA相互作用預(yù)測

2.4 差異表達lncRNA的pre?miRNA預(yù)測

在miRBase 數(shù)據(jù)庫中，已知lncRNA（前10）預(yù)測pre?miRNA，結(jié)果如表4。其中n344462 的預(yù)測結(jié)果中，hsa?let?7a?1 為腫瘤活性抑制因子，而hsa?let?7f?1可抑制Bcl?xL 基因的表達；未知lncRNA 預(yù)測得到的pre?miRNA，由于尚無成熟的數(shù)據(jù)庫，結(jié)果僅以堿基序列的形式表達，見表5。

表4 已知lncRNA的pre?miRNA預(yù)測結(jié)果

表5 未知lncRNA的pre?miRNA預(yù)測結(jié)果

2.5 差異表達lncRNA驗證結(jié)果

在ADE 與對照組中8 個高表達lncRNA（4 個已知，4 個未知）和8 個低表達lncRNA（4 個已知，4 個未知）中擴增出8 個已知lncRNA，5 個未知lncRNA。根據(jù)循環(huán)參數(shù)差值在兩組間計算的相對表達量值2?ΔCt進行兩樣本t檢驗，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖2。

圖2 ADE與對照組lncRNA差異表達（2?Δct）

3 討論

LncRNA 參與宿主與病毒之間的相互作用及調(diào)控[10]，還可作為小RNA 的前體發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用[16]，影響細胞內(nèi)及生物體發(fā)育過程中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[17]。在感染性疾病中差異表達及作用機制受到愈來愈多的關(guān)注。本研究通過建立ADE 模擬感染肝細胞，利用RNA?Seq 及生物信息學(xué)方法，根據(jù)設(shè)定的差異表達閾值得到差異表達的lncRNA。作為抗病毒感染和抗炎癥反應(yīng)中的負調(diào)控因子[18]，宿主的lncRNA可參與病毒的復(fù)制以及調(diào)控宿主的先天免疫反應(yīng)[19]以及調(diào)控內(nèi)源性miRNA 的表達功能[20]。本研究通過預(yù)測差異表達lncRNA 潛在的靶基因和miRNA 的前體，結(jié)果進一步證實了某些差異表達lncRNA 具有重要的生物學(xué)功能，利用RT?qPCR擴增結(jié)果轉(zhuǎn)換成的相對表達量在對比組間的數(shù)值關(guān)系與生物信息學(xué)分析的差異表達結(jié)果基本一致。本研究初次得到的差異表達lncRNA信息可為深入研究登革病毒感染引起肝細胞損傷機制提供一定科學(xué)依據(jù)。