吳 赟，曹 錕，張廣獻(xiàn) （.廣東醫(yī)科大學(xué)廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點實驗室，廣東東莞 53808；.廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 50006）

芋螺毒素是海洋軟體動物芋螺的毒管組織分泌的由10～50個氨基酸殘基組成的小肽[1]。芋螺毒素通過選擇性靶向不同類型的神經(jīng)遞質(zhì)受體或電壓門控離子通道，通常被用作神經(jīng)科學(xué)研究和藥物開發(fā)的分子工具[2?3]。根據(jù)芋螺毒素保守的信號肽序列，可以將數(shù)目繁多的芋螺毒素分成29 個超家族[4]。其中A?超家族芋螺毒素又可根據(jù)藥理學(xué)作用靶點進一步分為α?、κA?、αA?家族。α?家族芋螺毒素具有典型的CC?C?C半胱氨酸框架，通常由12～19個氨基酸殘基組成，主要作用靶點為煙堿型乙酰膽堿受體(nAChR)[5]。煙堿型乙酰膽堿受體(nAChR)分為肌肉型和神經(jīng)型兩種，其中肌肉型nAChR 普遍存在于脊椎動物骨骼肌細(xì)胞以及某些魚的放電器官細(xì)胞的質(zhì)膜上。受體與乙酰膽堿結(jié)合，引起Na+通道的開放，Na+流入靶細(xì)胞，使得質(zhì)膜去極化并引起細(xì)胞的收縮。α?芋螺毒素能與神經(jīng)肌肉接頭處突觸后膜上nAChR的α亞基結(jié)合，從而競爭性地抑制乙酰膽堿與受體結(jié)合，阻斷神經(jīng)?肌肉興奮信號的傳遞[6]。目前在具有抗皺功能的化妝品中廣泛應(yīng)用的蛇毒SYN?AKE 是1 種來源蛇毒的三肽[7]，它主要作用于肌肉型nAChR 的突觸后膜，從而抑制神經(jīng)肌肉收縮。本研究從α?芋螺毒素中篩選并合成了4 種多肽，探討這些多肽對肌肉收縮的抑制作用及其應(yīng)用前景，旨在為開發(fā)新型抗皮膚皺紋產(chǎn)品提供參考。

1 材料和方法

1.1 多肽合成

合成的多肽序列見表1。采用Fmoc 法[8]，通過全自動多肽合成儀（海南建邦制藥科技有限公司，型號JB2014001）進行多肽的合成。從儀器上裂解下來的多肽，用乙醚沉淀后，在1 500×g下離心10 min。收集沉淀，進行冷凍干燥。取少量凍干后的粗肽溶解，經(jīng)10 000×g 離心2 min 去除雜質(zhì)后，上C18 反相柱進行高效液相色譜（HPLC）檢測及純化。線性梯度洗脫，215 nm 和280 nm 處雙波長檢測。將HPLC 收集的目標(biāo)峰取1 μL，進行質(zhì)譜檢測分析。確定多肽分子量正確后，用于后續(xù)實驗。根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果，收集HPLC 純化后的目的峰，再次凍干。再經(jīng)HPLC 純化，經(jīng)檢測達(dá)到95%以上純度后，第3 次凍干成粉末，?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 所合成的4個多肽序列

1.2 肌細(xì)胞收縮檢測

使用Cell Biolabs 公司的細(xì)胞收縮檢測試劑盒（Collagen?based Contraction Assay Kit,CBA?201）評估肌肉細(xì)胞的收縮性。將人骨骼肌細(xì)胞（HSMC，美國ATCC）在骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)基（skeletal muscle cell medium,SkMCM，ScienCell 公司，3501?b）中，37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。將采集的細(xì)胞進行重懸，使細(xì)胞終濃度為（2～5）×106個細(xì)胞/mL 培養(yǎng)基。將2倍體積的細(xì)胞懸液和8 倍體積的預(yù)冷的膠原凝膠溶液混合制成膠原晶格。在24 孔板的每個孔中加入0.5 mL的細(xì)胞?膠原混合液，在37 ℃孵育1 h。當(dāng)膠原聚合后，向凝膠晶格中添加1.0 mL 培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h，期間觀察膠原的收縮變化。在釋放收縮基質(zhì)之前，用濃度為100 μmol/L 的多肽溶液處理細(xì)胞1 h。24 h 后用直尺測量膠原凝膠大小的變化。使用細(xì)胞培養(yǎng)基作為陰性對照，蛇毒三肽SYN?AKE 作為陽性對照。收縮率（mm）=釋放前膠原凝膠的直徑?釋放24 h 后膠原凝膠的直徑。

1.3 骨骼肌收縮檢測

實驗所用SD大鼠購買自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心[許可證號SYXK（粵）2018?0182]。30 只大鼠（150～200 g）分為6 組，每組5 只。1 組為陰性對照組，用臺氏液代替多肽處理組織；1 組為陽性對照組（SYN?AKE）；剩余4 組分別檢測不同的樣品多肽。大鼠腹腔注射1 mL 10%的水合氯醛進行麻醉后，剃去大鼠后肢及軀干后背部的毛，剪開皮膚，小心剝離，暴露肌層。分離腓腸肌內(nèi)外側(cè)頭至踝關(guān)節(jié)，游離腓腸肌內(nèi)側(cè)頭肌腱，并用手術(shù)線結(jié)扎，剪斷。于腓腸肌根部肌腱處結(jié)線接張力換能器，坐骨神經(jīng)置于刺激電極上，接入BL?420E生物機能實驗系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）。以連續(xù)單刺激的方式給予坐骨神經(jīng)電刺激，刺激參數(shù)為：延時l00 ms，波寬0.5 ms，頻率0.5 Hz，強度5 V，掃描速度為4.00 s/div，待模型穩(wěn)定后，記錄腓腸肌收縮的張力大小作為多肽作用前的對照。用無菌脫脂棉給藥，待測藥品工作濃度為100 μmol/L。每隔5 min 給予坐骨神經(jīng)電刺激，記錄腓腸肌收縮曲線，至腓腸肌收縮作用至25 min。

1.4 細(xì)胞毒性檢測

使用96孔板培養(yǎng)和MTT染色法檢測多肽對人骨骼肌細(xì)胞的細(xì)胞毒性[9]。人骨骼肌細(xì)胞在骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)基中，37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。將細(xì)胞以約105個/mL 接種于96 孔板，每孔接種90 μL，置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。按預(yù)設(shè)的濃度梯度分別加入10 μL 的多肽，使每孔中的多肽終濃度為1、2、5、10、20、50、100 μmol/L，每1 個梯度設(shè)置3 個重復(fù)?？瞻捉M加入100 μL 骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL 的MTT（5 g/L），然后置于37 ℃溫育4 h。小心除去上清后，每孔加入100 μL DMSO，振蕩約10 min 溶解沉淀，隨后用酶標(biāo)儀檢測OD 值，波長490 nm。

1.5 皮膚刺激性/腐蝕性檢測

根據(jù)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015 年版中毒理學(xué)試驗方法中的皮膚刺激性/腐蝕性試驗方法檢測多肽對家兔皮膚的刺激性/腐蝕性。新西蘭白色家兔4 只（質(zhì)量合格證號：44007600002312），身體質(zhì)量2.3～2.4 kg，購自廣州花都區(qū)花東信華實驗動物養(yǎng)殖場[許可證號為SCXK（粵）2019?0023]。試驗前24 h，將家兔背部脊柱兩側(cè)被毛剪掉，剪毛中不損傷皮膚表面，去毛范圍為3 cm×3 cm，涂抹面積為2.5 cm×2.5 cm。取0.5 mL 濃度為1 mmol/L 的多肽溶液涂抹在一側(cè)皮膚上，另一側(cè)涂0.5 mL 純化水作為對照，每天涂抹一次，連續(xù)涂抹14 d。涂抹1 h 后觀察結(jié)果，按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015 年版的皮膚刺激性/腐蝕性試驗表1標(biāo)準(zhǔn)進行評分。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

各實驗組數(shù)據(jù)分別與對照組比較，采用t檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。各圖中的所有誤差線表示至少3次重復(fù)計算的平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。

2 結(jié)果

2.1 多肽的合成與純化

所合成的4 個多肽（芋螺毒素SI[10]、Reg1d[11]和多肽片段SDPR、ELDGNG[12]）均選自A超家族芋螺毒素（序列見表1）。采用全自動合成了上述多肽，并用RP?HPLC 對其進行了純化，通過質(zhì)譜鑒定了多肽的分子量（圖1）。

圖1 經(jīng)HPLC純化后的4個多肽的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

2.2 多肽對肌細(xì)胞收縮的抑制作用

通過比較膠原凝膠在多肽處理前后的直徑變化，發(fā)現(xiàn)多肽Reg1d、SDPR 和ELDGNG 對人骨骼肌細(xì)胞的收縮有一定的抑制作用。而多肽SI 對骨骼肌細(xì)胞的收縮沒有明顯抑制作用（圖2）。以上結(jié)果均至少重復(fù)3次。

圖2 4個多肽對肌細(xì)胞收縮的抑制作用

2.3 多肽對骨骼肌收縮的抑制作用

使用芋螺毒素Reg1d 處理腓腸肌后，對肌肉收縮的抑制作用明顯，25 min 時的抑制作用與陽性對照SYN?AKE 的抑制作用相當(dāng)；芋螺毒素SI 對骨骼肌收縮只有微量的抑制作用；而多肽SDPR和ELDGNG則對腓腸肌的收縮沒有明顯作用（圖3）。

圖3 4個多肽對不同時間點的大鼠骨骼肌收縮的抑制作用

2.4 芋螺毒素Reg1d的細(xì)胞安全性檢測

根據(jù)以上肌細(xì)胞收縮和骨骼肌收縮實驗的結(jié)果，選擇了芋螺毒素Reg1d 進行接下來的細(xì)胞安全性和皮膚安全性檢測。實驗結(jié)果顯示，在7 個檢測濃度下，Reg1d 對骨骼肌細(xì)胞的存活均沒有明顯毒性作用（圖4）。

圖4 芋螺毒素Reg1d對人骨骼肌細(xì)胞存活率的影響

2.5 芋螺毒素Reg1d的皮膚安全性檢測

根據(jù)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015 年版中的皮膚刺激性/腐蝕性試驗方法檢測芋螺毒素Reg1d 對家兔皮膚的刺激性/腐蝕性。在試驗觀察期內(nèi)家兔均沒有出現(xiàn)紅斑和水腫；每天每只動物平均積分為0，未見其他毒性反應(yīng)特征，表明1 mmol/L的Reg1d對皮膚多次給藥，無刺激性。結(jié)果見表2。

表2 芋螺毒素Reg1d對家兔多次皮膚刺激性試驗結(jié)果

3 討論

芋螺毒素對不同的離子通道、G 蛋白偶聯(lián)受體和神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運體具有高度的特異性和親和力[13]。目前已經(jīng)有一些芋螺毒素正在處于臨床試驗階段，其中的μ?芋螺毒素MVIIA，已被美國FDA 批準(zhǔn)用于治療難以控制的嚴(yán)重慢性疼痛[14]。α?芋螺毒素是nAChRs抑制劑，其在芋螺物種中的豐富表達(dá)，為尋找nAChRs的靶向藥物，提供了一個具有可變初級序列、結(jié)構(gòu)、藥理特性和作用方式的天然多肽庫[15]。某些α?芋螺毒素的高亞型選擇性是鑒定天然nAChR 亞型參與神經(jīng)遞質(zhì)釋放調(diào)控的關(guān)鍵[16]。α?芋螺毒素的結(jié)構(gòu)/功能特性也促進了具有更高效價和/或亞型選擇性的毒素多肽類似物的開發(fā)。在本研究中，主要考察4 個來源于α?芋螺毒素的多肽對于肌肉收縮的抑制作用，其中芋螺毒素Reg1d 對肌細(xì)胞和骨骼肌的收縮表現(xiàn)出了明顯的抑制作用，同時也具有的良好的安全性。

為減小芋螺毒素的分子量，使其更適合于藥物應(yīng)用，此前已經(jīng)文獻(xiàn)報道了一些方法，例如將芋螺毒素MII 或MrIA 的N 到C 端環(huán)化以及用二硒環(huán)化鍵取代二硫鍵[17?18]，用化學(xué)柔性間隔物替換芋螺毒素SIIIA序列中的部分氨基酸等[19]。然而，這些方法并不能完全去除芋螺毒素中的二硫鍵。芋螺毒素的分子量仍然較大。在本研究中，我們從α?芋螺毒素中選擇并設(shè)計了4 個多肽。其中包括2 個全長的芋螺毒素SI 和Reg1d，以及2 個來自于芋螺毒素的多肽片段SDPR和ELDGNG。我們期望通過相關(guān)的功能實驗，了解多肽片段是否具有與完整毒素類似的活性。然而實驗結(jié)果顯示，2 個多肽片段并未表現(xiàn)出優(yōu)于或接近完整毒素的活性，這可能與多肽片段的選擇有關(guān)。在芋螺毒素的氨基酸序列中，除了保持基本空間結(jié)構(gòu)的半胱氨酸外，剩余的氨基酸中有些與毒素的功能密切相關(guān)，有些與毒素的特異性相關(guān)，還有一些與毒素的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定相關(guān)。在接下來的研究中，我們將從更多的芋螺毒素中選擇更多的多肽片段來進行功能檢測。

本研究選擇了來源于蛇毒的三肽化合物SYN?AKE 作為陽性對照。SYN?AKE 是一種基于合成蛋白質(zhì)片段的化學(xué)物質(zhì)，該片段源自廟蝰蛇蛇毒中的Waglerin?1 肽，可以減少肌肉細(xì)胞的收縮。因此，SYN?AKE 被廣泛地應(yīng)用到了抗皺類的化妝品中[20]。與SYN?AKE 相比，芋螺毒素Reg1d 表現(xiàn)出了相似的生物活性。雖然Reg1d 的分子量較大，但是它具有良好的生物安全性。在后續(xù)試驗中，可以通過特定氨基酸的去除和替換，進一步降低Reg1d的分子量，Reg1d依然有望開發(fā)成為一種新的原料，應(yīng)用于抗皺紋類化妝品中。