孫曉富，董 超*，李文靜，張豐文

（河北省科學院生物研究所，河北 石家莊 050000）

鈣元素是人體骨骼和牙齒的重要組成部分，在人體生物代謝活動中有著重要作用，當鈣攝入量不足或生物利用率低時，可使機體造成鈣的缺乏，導致佝僂癥、骨質(zhì)疏松等疾病的發(fā)生[1]。據(jù)最新中國居民營養(yǎng)與健康狀況監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示[2-3]，我國城鄉(xiāng)居民人均日攝入鈣366.1 mg，不足推薦攝入量（800 mg）的50%，達到適宜攝入量的人群不足5%，國民對補鈣的健康需求較大[4]。我國補鈣產(chǎn)品的發(fā)展歷程大概分為三代：一代碳酸鈣為無機鈣，二代是以檸檬酸鈣、乳酸鈣和葡萄糖酸鈣等有機鹽鈣為主，這兩代補鈣產(chǎn)品的溶解性差、對胃有強烈刺激、生物利用率低，攝入不當會對人體有一定程度的副作用，如引發(fā)動脈粥樣硬化痙攣或腎結(jié)石等疾病；氨基酸及多肽螯合鈣作為第三代補鈣制劑具有易吸收、穩(wěn)定性好、安全性高等優(yōu)點[5-7]，市場發(fā)展前景廣闊。

大豆是人體所需蛋白質(zhì)的重要來源之一，含有18種氨基酸，包括9種人體必需氨基酸[8]。牛骨粉中60%～65%為礦物質(zhì)，幾乎包含了人體所需的全部礦物質(zhì)成分，其中鈣含量達到19%，具有人體吸收的最佳鈣磷比，但牛骨粉中的鈣主要以羥基磷灰石鈣為主要存在形式，并且與膠原蛋白形成緊密結(jié)構(gòu)，不易被人體吸收[9-10]。納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）在發(fā)酵過程中分泌蛋白酶，可以將大豆蛋白分解成更易人體吸收的小分子肽和氨基酸，也可以將牛骨粉中的膠原蛋白分解為多肽[11-12]，有利于其中鈣的析出和溶解。

本研究以牛骨粉和大豆粉為主要原料，選用納豆芽孢桿菌SWS-001發(fā)酵制備多肽螯合鈣，并以螯合鈣含量為響應值，采用單因素試驗及響應面試驗對其制備工藝進行優(yōu)化，為多肽螯合鈣的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

大豆：黑龍江大豆生產(chǎn)基地；牛骨粉（宏越7710X）：市售；納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）SWS-001（CGMCC No.17226）：河北省生物所微生物室保存。

1.1.2 試劑

乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）（分析純）：北京化工廠；無水乙醇（分析純）：天津永大化學試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基[13]：蛋白胨1%，牛肉浸膏0.5%，NaCl 0.5%，pH值7.5，121 ℃高壓滅菌30 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基[14-15]：牛骨粉3%，大豆粉5%，葡萄糖0.5%，KH2PO40.2%，K2HPO4·3H2O 0.52%，MgSO4·7H2O 0.1%，pH值7.5，121 ℃高壓滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

75004250 Heraeus Multifuge X1R離心機：美國Thermo Fisher Scientific公司；MLS-3020高壓蒸汽滅菌鍋：日本SANYO公司；SKY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海蘇坤實業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 螯合鈣的制備工藝

將斜面保存的納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）SWS-001接種于種子培養(yǎng)基，于33 ℃、200 r/min條件下發(fā)酵8 h；將種子液按4%（V/V）的接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，于33 ℃、200 r/min條件下發(fā)酵60 h。

1.3.2 螯合鈣制備工藝優(yōu)化單因素試驗

以液體發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎，通過單因素試驗依次分別考察牛骨粉（2%、3%、4%、5%、6%）、大豆粉（1%、3%、5%、7%、9%）、葡萄糖（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%）、KH2PO4（0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%）、K2HPO4·3H2O（0.26%、0.39%、0.52%、0.65%、0.78%）、MgSO4·7H2O（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）添加量對納豆芽孢桿菌SWS-001發(fā)酵產(chǎn)螯合鈣的影響，確定最佳培養(yǎng)基組成。

1.3.3 螯合鈣制備工藝優(yōu)化Plackett-Burman試驗

結(jié)合單因素試驗結(jié)果，選取各因素適宜的水平范圍，采用Plackett-Burman（PB）法[16]對影響螯合鈣生成的6種因素進行評估。PB試驗因素與水平見表1，各因素設計高低（1和-1）2個水平，以螯合鈣含量（Y）為響應值，對6個試驗因素進行顯著性分析，篩選出具有顯著影響的因素。

表1 螯合鈣制備工藝優(yōu)化Plackett-Burman試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman tests for chelated calcium preparation process optimization

1.3.4 螯合鈣制備工藝優(yōu)化響應面分析

結(jié)合單因素試驗和PB試驗的結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理[17-18]，以螯合鈣（Y）含量為響應值，牛骨粉含量（A）、大豆粉含量（B）、葡萄糖含量（C）為自變量，進行3因素3水平的響應面試驗優(yōu)化，試驗設計因素與水平見表2。

表2 螯合鈣制備工藝優(yōu)化響應面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface tests for chelating calcium preparation process optimization

1.3.5 螯合鈣的測定方法

發(fā)酵液在4 ℃、4 000 r/min條件下離心10 min，取上清液5 mL逐滴加入45 mL無水乙醇中充分混勻振蕩，靜置30 min后于4 ℃、8 000 r/min條件下離心20 min，棄上清，沉淀即為螯合鈣粗提物[19]。沉淀中加入10 mL 2 mol/L的鹽酸進行水解，參考文獻[20]的EDTA絡合滴定法測定螯合態(tài)鈣的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 不同牛骨粉含量對螯合鈣產(chǎn)量的影響

不同牛骨粉含量對納豆芽孢桿菌SWS-001發(fā)酵產(chǎn)螯合鈣的影響見圖1。由圖1可知，隨著牛骨粉含量的增加，螯合鈣產(chǎn)量呈先升高后降低的趨勢，當牛骨粉含量為4%時，螯合鈣的產(chǎn)量達到最高，為（600.89±13.44）mg/L。因此，確定最佳牛骨粉含量為4%。

圖1 不同牛骨粉含量對螯合鈣產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of different bovine bone powder contents on the yield of chelated calcium

2.1.2 不同大豆粉含量對螯合鈣產(chǎn)量的影響

由圖2可知，螯合鈣產(chǎn)量呈先升高后降低的趨勢，當大豆粉含量為5%時，螯合鈣的產(chǎn)量達到最高，為（565.97±6.72）mg/L。因此，確定最佳大豆粉含量為5%。

圖2 不同大豆粉含量對螯合鈣產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of different soybean powder contents on the yield of chelated calcium

2.1.3 不同葡萄糖含量對螯合鈣產(chǎn)量的影響

由圖3可知，隨著葡萄糖含量的升高，螯合鈣產(chǎn)量呈先升高后降低的趨勢。當葡萄糖含量為0.5%時，螯合鈣的產(chǎn)量達到最高，為（554.33±13.44）mg/L。因此，確定葡萄糖的最佳含量為0.5%。

圖3 不同葡萄糖含量對螯合鈣產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of different glucose contents on the yield of chelated calcium

2.1.4 不同KH2PO4含量對螯合鈣產(chǎn)量的影響

由圖4可知，隨著KH2PO4含量的升高，螯合鈣產(chǎn)量呈先升高后降低的趨勢；當KH2PO4含量為0.20%時，螯合鈣的產(chǎn)量達到最高，為（573.73±29.30）mg/L。因此，確定KH2PO4的最佳含量為0.20%。

圖4 不同KH2PO4含量對螯合鈣產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of different KH2PO4 contents on the yield of chelated calcium

2.1.5 不同K2HPO4·3H2O含量對螯合鈣產(chǎn)量的影響

由圖5可知，隨著K2HPO4·3H2O含量的增加，螯合鈣產(chǎn)量呈先升高后降低且整體平緩的趨勢，可見K2HPO4·3H2O含量對螯合鈣的生成影響不大[21]。當K2HPO4·3H2O含量為0.52%時，螯合鈣的產(chǎn)量達到最高，為（577.61±6.72）mg/L。因此，確定K2HPO4·3H2O的最佳含量為0.52%。

圖5 不同K2HPO4·3H2O含量對螯合鈣產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of different K2HPO4·3H2O contents on the yield of chelated calcium

2.1.6 不同MgSO4·7H2O含量對螯合鈣產(chǎn)量的影響

由圖6可知，隨著MgSO4·7H2O含量的增加，螯合鈣產(chǎn)量整體呈現(xiàn)降低的趨勢，當MgSO4·7H2O含量＞0.10%之后，螯合鈣的產(chǎn)量隨MgSO4·7H2O含量的增加而降低；這可能是由于金屬離子在一定濃度范圍內(nèi)對發(fā)酵有促進作用，過高則會抑制菌體的生長代謝[22]，進而影響螯合鈣的生成。當MgSO4·7H2O含量為0.10%時，螯合鈣的產(chǎn)量達到最高，為（562.09±17.78）mg/L。因此，確定MgSO4·7H2O的最佳含量為0.10%。

圖6 不同MgSO4·7H2O含量對螯合鈣產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of different MgSO4·7H2O contents on the yield of chelated calcium

2.2 Plackett-Burman試驗結(jié)果

由表3及表4可知，6個因素對螯合鈣生成的影響由高到低依次為牛骨粉、大豆粉、葡萄糖、MgSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4·3H2O，其中牛骨粉、大豆粉、葡萄糖影響極顯著（P＜0.01），因此選擇牛骨粉、大豆粉和葡萄糖含量作為3個主要因素進行響應面分析。

表3 Plackett-Burman試驗設計與結(jié)果Table 3 Design and results of Plackett-Burman tests

表4 Plackett-Burman模型方差分析Table 4 Variance analysis of Plackett-Burman model

2.3 響應面試驗結(jié)果

2.3.1 Box-Behnken試驗設計及結(jié)果

Box-Behnken試驗設計及結(jié)果見表5，方差分析見表6。

通過對表5數(shù)據(jù)的多元回歸擬合，獲得螯合鈣（Y）的二次多元回歸模型方程：

表5 Box-Behnken試驗設計及結(jié)果Table 5 Design and results of Box-Behnken tests

由表6可知，此模型的P值＜0.001，極顯著，失擬項P值=0.123 2＞0.05，不顯著，說明試驗中未考慮的因素對結(jié)果影響不顯著。決定系數(shù)R2=0.993 8，調(diào)整系數(shù)R2Adj=0.982 7，說明該模型可準確反映各因素對螯合鈣生成的影響，模型對實際情況擬合良好[23]。一次項A、B、C及二次項A2、C2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），交互項AC對結(jié)果影響顯著（P＜0.05），而其他項對結(jié)果不顯著（P＞0.05）。

表6 Box-Behnken模型方差分析Table 6 Variance analysis of Box-Behnken model

2.3.2 響應面試驗結(jié)果分析

由Design-Expert10.0軟件分析得到各因素間交互作用對納豆芽孢桿菌SWS-001發(fā)酵生產(chǎn)螯合鈣的影響的響應面及等高線見圖7。響應面坡面越陡峭，說明在控制一個因素不變時，其余兩個因素間的交互作用對響應值影響越顯著[24-25]，由圖7可知，牛骨粉、大豆粉和葡萄糖兩兩因素之間均有交互作用，其中A（牛骨粉）和C（葡萄糖）的交互作用對響應值螯合鈣影響顯著。

圖7 牛骨粉、大豆粉和葡萄糖含量間交互作用對螯合鈣產(chǎn)量影響的響應面及等高線Fig.7 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between bovine bone powder,soybean flour and glucose contents on chelated calcium yield

2.3.3 響應面結(jié)果驗證性試驗

根據(jù)響應面試驗模型結(jié)果計算可知，3個因素的最佳配比為牛骨粉3.49%，大豆粉4.81%，葡萄糖0.47%，在此條件下預測得到發(fā)酵液中螯合鈣含量為692.35 mg/L。為實際稱量考慮，3個因素添加量分別為牛骨粉3.5%，大豆粉4.8%，葡萄糖0.5%進行發(fā)酵制備螯合鈣，重復3次，發(fā)酵液中螯合鈣含量為（707.47±32.16）mg/L，與預測值接近。這說明該回歸模型可以為實際操作提供指導。

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗及響應面試驗確定了納豆芽孢桿菌發(fā)酵制備螯合鈣的最優(yōu)培養(yǎng)基為牛骨粉3.5%，大豆粉4.8%，葡萄糖0.5%，KH2PO40.2%，K2HPO4·3H2O 0.52%，MgSO4·7H2O 0.1%，在此條件下，發(fā)酵液中螯合鈣的含量達到（707.47±32.16）mg/L，與優(yōu)化前相比提高了29.42%，可以為螯合鈣的進一步研究與工業(yè)化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。