胡一明 張藝 徐旭燕

咸寧市中心醫(yī)院 湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 437100

肺癌是極為常見的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占所有肺癌的80%～85%[1]。傳統(tǒng)上對于NSCLC的治療多為手術(shù)切除、放化療等綜合治療，其中手術(shù)切除可以獲得較好的預(yù)后，但大部分患者確診時已處于晚期，總體5年生存率只有15%左右[2-3]。近年來，以吉非替尼為代表的分子靶向治療在NSCLC治療中發(fā)揮重要作用，但隨著疾病進展，其耐藥問題仍成為制約療效的瓶頸。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lnc RNA)是一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，多作為腫瘤促癌基因參與調(diào)控基因的表達，與多種腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4]。lnc RNA在多種類型腫瘤中呈特異性表達，與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，lnc RNA是多種腫瘤(如肝癌、胃癌和肺癌等)早期診斷的標(biāo)志物[5-7]。lncRNA肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)作為與肺癌有關(guān)的lnc RNA[8]，也被認(rèn)為是肺癌的特異性指標(biāo)之一[9]。miRNA作為MALAT1的靶基因，在MALAT1生物學(xué)功能的發(fā)揮中扮演重要角色。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miR-200a可通過多種信號途徑發(fā)揮抑癌或促癌作用，但是在NSCLC中l(wèi)ncRNA MALAT1與miR-200a表達之間的關(guān)系尚不明確。本文旨在研究NSCLC中l(wèi)ncRNA MALAT1與miR-200a表達之間的關(guān)系，為臨床NSCLC的診斷、治療或新藥研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 前瞻性研究。收集2016年1月至2019年6月在咸寧市中心醫(yī)院手術(shù)切除的90例原發(fā)性NSCLC組織及其癌旁組織，迅速保存在液氮中。其中男42例，女48例；年齡(59.5±6.5)歲，年齡范圍為45～80歲；肺腺癌57例，肺鱗癌23例；肺癌TNM分期Ⅰ期28例，Ⅱ期37例，Ⅲ期25例。本研究符合《赫爾辛基宣言》的原則。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者均經(jīng)胸部CT和病理組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)檢查確診為NSCLC；(2)既往未接受手術(shù)、放療、化療、分子靶向治療及免疫治療等一切治療方法；(3)病理資料完整者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往接受任何手術(shù)、放療、化療、分子靶向治療及免疫治療者；(2)合并免疫系統(tǒng)疾病者；(3)合并其他惡性腫瘤者。

1.3 細(xì)胞株 人NSCLC細(xì)胞A549購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。

1.4 主要儀器及試劑 RPMI1640培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；胰蛋白酶(上海生物工程有限公司)；Trizol試劑(美國英杰公司)；高速冷凍離心機(美國Thermo Fisher公司)；PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒及TB GreenTMPremix Ex TaqTM試劑盒(大連寶 生 物 公 司)；sh-MALAT1、siRNA-control、miR-200a-mimic、miR-200a inhibitor(上海吉滿生物科技有限公司)；Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；雙熒光素酶測定系統(tǒng)(美國Promega公司)；CCK-8試劑盒(美國Promega公司)；Annexin-V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(美國eBioscience公司)；實時熒光定量PCR儀(美國Thermo Fisher公司)。

1.5 實驗方法

1.5.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將肺癌細(xì)胞A549培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基(包含10%胎牛血清+1%雙抗)中，5%CO2、37℃恒溫箱中孵育72 h，當(dāng)細(xì)胞密度生長到80%時進行傳代培養(yǎng)。用胰酶將A549細(xì) 胞 消 化 并 鋪 板，分 為sh-Ctrl組、sh-MALAT1組、miR-200a-mimic組、miR-200ainhibitor組、sh-MALAT1+miR-200a-inhibitor組和sh-MALAT1+miR-200a-mimic組，按 照Lipofectamine 2000的操作說明書進行轉(zhuǎn)染，將sh-MALAT1和miR-200a-inhibitor分別或同時轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，只轉(zhuǎn)染Lipofectamine 2000作為sh-Ctrl組，只 轉(zhuǎn) 染miR-200a-mimic作 為miR-200a-mimic組。

1.5.2 實時熒光定量PCR檢測肺癌組織和細(xì)胞中MALAT1、miR-200a表達 根據(jù)Trizol試劑說明書，采用Trizol法提取NSCLC組織及其癌旁組織和細(xì)胞系中的總RNA，分光光度儀測定m RNA濃度，按PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒說明書將樣本中的m RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并保存于-20℃中備用。采用實時熒光定量PCR法測定NSCLC組織及其癌旁組織和細(xì)胞中MALAT1、miR-200a水平。以GAPDH作為內(nèi)參，引物序列如下。GAPDH正向引物：5'-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3'，反向引物：5'-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3'；MALAT1正 向引物：5'-GAAGATAGGCATTTGAGTGGCT-3'，反向引物：5'-CTGAAGAGCATT-GGAGATCAGC-3'。PCR

反應(yīng)體系(20μl)：2μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、10μl SYBR Green Mix、正反向引物(10μmol/L)各0.5μl；PCR反應(yīng)步驟及參數(shù)：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性10 s，60℃退火延伸5 s(共40個循環(huán))，每個樣本設(shè)3個復(fù)孔，根據(jù)溶解曲線判斷產(chǎn)物的特異性。根據(jù)測得的CT值，采用2-ΔΔct法計算樣本中MALAT1、miR-200a的相對表達量。

1.5.3 MTT法檢測A549細(xì)胞的增殖 將對數(shù)生長期細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，重懸，以1×103cells/孔接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃、5% CO2培養(yǎng)7 d后，加入濃度為5 g/L的MTT液10μl，繼續(xù)培養(yǎng)5 h，吸除上清液，每孔加入150 μl DMSO，室溫下攪拌10 min，分別在24、48、72和96 h測定各孔波長490 nm處的吸光度(optical density，OD)值，觀察增殖情況。細(xì)胞增殖率=(OD實驗孔-OD對照孔)/OD對照孔×100%。

1.5.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測A549細(xì)胞凋亡 將A549細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用PBS洗滌細(xì)胞2～3次，然后用胰蛋白酶消化，再用PBS重懸細(xì)胞并調(diào)整至細(xì)胞密度為1×105cells/ml。吸取細(xì)胞懸液1 ml置 于 離 心 管 中，離 心 半 徑8.5 cm，4℃1 000 r/min離心10 min，棄去上清；加入預(yù)冷的PBS 1 ml重懸細(xì)胞，離心后吸棄上清，PBS洗1次；加入Binding Buffer 200μl重懸細(xì)胞，加入PI和Annexin-V后充分混勻，室溫下避光靜置20 min；加300μl結(jié)合緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞，計算細(xì)胞凋亡率。

1.5.5 雙熒光素酶報告基因法檢測MALAT1與miR-200a之間的關(guān)系 將miR-200a的3'UTR區(qū)構(gòu)建入海腎熒光素酶報告基因下游區(qū)，螢火蟲熒光素報告基因作為內(nèi)參對照基因，與MALAT1共同轉(zhuǎn)染進入A549細(xì)胞，然后將A549細(xì)胞接種在24孔板中，分別用報告基因載體和miR-200a-mimic轉(zhuǎn)染24 h，根據(jù)說明書，進行熒光素酶報告分析；其中miR-200a：5'-GACAGGATTCCAGGAACCAGTGTTT-3'；MALAT 1：3'-TGTAGCAATGGTCTATTGTCACAAT-5'。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 本研究數(shù)據(jù)在SPSS 21.0軟件中進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以x-±s的形式表示，組間差異采用兩獨立樣本的t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC癌組織和癌旁組織MALAT1表達 NSCLC組織中MALAT1相對表達水平高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.589，P＜0.001)，見圖1。

圖1 非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁組織MALATA1表達水平比較

2.2 sh-Ctrl組 與sh-MALAT1組MALAT1表達 與sh-Ctrl組相比，sh-MALAT1組的MALAT 1表達水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.954，P＜0.001)。見圖2。

圖2 sh-Ctrl組與sh-MALAT1組MALAT1表達水平比較

2.3 各組miR-200a表達水平比較 與sh-Ctrl組相比，sh-MALAT1組miR-200a表達水平升高(t=7.908，P＜0.001)，miR-200a-inhibitor組miR-200a表達水平下降(t=5.187，P＜0.001)；與sh-MALAT1+miR-200a-inhibitor組 相 比，miR-200a-inhibitor組miR-200a表達水平下降(t=8.571，P＜0.001)，sh-MALAT1組miR-200a表達水平升高(t=5.284，P＜0.001)。見圖3。

圖3 各組miR-200a表達水平比較

2.4 MALAT1與miR-200a關(guān)系 熒光素酶實驗結(jié)果顯示：與sh-Ctrl組相比，miR-200a-mimic組的熒光素酶活性明顯下降(t=4.536，P＜0.001)；而sh-MALAT1組和sh-MALAT+miR-200amimic組的熒光素酶活性比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.247，P=0.834)。見圖4。

圖4 熒光素酶分析MALAT1與miR-200a的靶向關(guān)系

2.5 各組A549細(xì)胞增殖情況比較 采用MTT法檢測MALAT1和miR-200a對A549細(xì)胞增殖的影響。與sh-Ctrl組相比，sh-MALAT1組細(xì)胞增殖 率 降 低(t=4.158，P＜0.001)；與sh-MALAT1組 相 比，sh-MALAT1+miR-200ainhibitor組細(xì)胞增殖率增加(t=3.895，P=0.001)。見圖5。

圖5 各組A549細(xì)胞增殖情況比較

2.6 各組A549細(xì)胞凋亡情況比較 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測MALAT1和miR-200a對A549細(xì)胞凋亡的影響。與sh-Ctrl組相比，sh-MALAT1組細(xì)胞凋亡率升高(t=5.012，P＜0.001)，miR-200ainhibitor組細(xì)胞凋亡率降低(t=3.861，P=0.032)；與sh-MALAT1+miR-200a-inhibitor組相比，sh-MALAT1組細(xì)胞凋亡率升高(t=3.748，P=0.035)，miR-200a-inhibitor組細(xì)胞凋亡率下降(t=4.703，P＜0.001)。見圖6。

圖6 各組A549細(xì)胞凋亡情況比較

3 討論

lncRNA是一類長度為200個核苷酸以上的非編碼RNA，本身并不編碼蛋白，多以RNA的形式參與機體多種生物學(xué)功能的調(diào)控，如基因表達的遺傳和表觀遺傳調(diào)控、基因表達的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控等[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，lnc RNA不僅在正常細(xì)胞增殖分化過程中發(fā)揮調(diào)控作用，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展等過程中亦具有重要作用[12]，惡性腫瘤中普遍存在異常lncRNA表達譜。MALAT1又稱核富集轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2(nuclear enrichment transcript，NEAT2)，是廣泛參與基因調(diào)控的lnc RNA，可選擇性地剪接或干擾基因表達[13]。MALAT1位于染色體11q13.1，被認(rèn)為是一種潛在的癌基因，可通過多種途徑調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為，影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[14]。

MALAT1可通過靶向調(diào)控miRNA的表達發(fā)揮生物學(xué)作用[15]。miRNA是廣泛存在于真核生物體內(nèi)的單鏈非編碼小分子RNA，MALAT1可特異性地與靶m RNA 3'UTR序列結(jié)合，導(dǎo)致靶m RNA降解或翻譯抑制，從而出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)控靶基因的表達[16]。研究證明，miRNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程有重要作用，與NSCLC增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)的miRNA包括miR-182、miR-200、miR-145等。其中miR-200a是miR-200家族一員，被認(rèn)為能調(diào)控上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，在某些腫瘤中表達下調(diào)促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[17]。

本研究顯示，NSCLC組織中的MALAT1表達水平顯著高于癌旁組織，提示MALAT1表達上調(diào)可能參與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展過程，且其高表達與預(yù)后不良相關(guān)[18-19]。MALAT1作為Ⅰ期肺腺癌或鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的負(fù)預(yù)測因子，與多種人類腫瘤相關(guān)，包括肝癌、腎細(xì)胞癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌和宮頸癌[20]。

目前對于MALAT1的調(diào)控機制研究表明，其可以靶向調(diào)控miRNA的表達發(fā)揮生物學(xué)功能，已知的靶基因有miR205、miRNA200a、miR23c等[21-22]。本研究利用siRNA靶向抑制MALAT1后miR-200a的表達水平顯著升高，且熒光素酶實驗結(jié)果顯示，在MALAT1突變體細(xì)胞中添加miR-200a-mimic對熒光素酶活性無明顯影響，提示MALAT1通過單向負(fù)調(diào)控miR-200a的表達來參與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展過程，這與文獻報道的調(diào)控機制一致[23]。王亞飛等[24]研究發(fā)現(xiàn)，miR-200a在肺癌細(xì)胞株中的表達水平低于正常肺上皮細(xì)胞株，miR-200a的高表達可下調(diào)ECFR和c-MET抑制肺癌細(xì)胞遷移和侵襲。

增殖實驗顯示，抑制MALAT1的表達導(dǎo)致NSCLC細(xì)胞的增殖率降低，同時抑制MALAT1和miR-200a的表達后NSCLC細(xì)胞的增殖率明顯增加，提示MALAT1可以抑制NSCLC細(xì)胞的增殖，并可能通過下調(diào)miR-200a起作用，該結(jié)果與文獻報道一致[25]。細(xì)胞凋亡實驗顯示，靶向抑制MALAT1的表達后，NSCLC細(xì)胞凋亡率顯著升高，當(dāng)同時抑制MALAT1和miR-200a的表達后NSCLC細(xì)胞凋亡率明顯下降，提示MALAT1通過靶向miR-200a抑制NACLC細(xì)胞的凋亡。其原因可能是MALAT1可以通過MALAT1/miR-200a信號通路來促進惡性腫瘤細(xì)胞的生長、遷移和侵襲，當(dāng)MALAT1表達下降，細(xì)胞內(nèi)的miR-200a表達上升，誘導(dǎo)下游程序性死亡配體表達增加，使腫瘤細(xì)胞程序性死亡[26]。許璐等[27]和Guo等[28]研究發(fā)現(xiàn)miR-200a在多種惡性腫瘤中通過靶向PI3K/AKT、TRAIL等途徑來抑制癌細(xì)胞增殖以及促進癌細(xì)胞凋亡，這與本研究結(jié)果相一致。

綜上所述，MALAT1和miR-200a均參與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展過程，其機制可能是MALAT1靶向上調(diào)miR-200a來促進NSCLC細(xì)胞的增殖以及抑制NSCLC細(xì)胞凋亡。因此，MALAT1和miR-200a可以作為NSCLC的潛在診斷或治療靶標(biāo)，具有一定的臨床應(yīng)用價值。但是miR-200a調(diào)控NSCLC細(xì)胞增殖的具體分子機制仍需進一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突